Новости

Спасибо, что посетили Nature.com.Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Раковые клетки выработали различные механизмы для преодоления клеточного стресса и продолжают прогрессировать.Протеинкиназа R (PKR) и ее активатор белка (PACT) являются первыми ответчиками, которые отслеживают различные сигналы стресса, приводящие к ингибированию клеточной пролиферации и апоптоза.Однако регуляция пути PACT-PKR в раковых клетках остается в значительной степени неизвестной.Здесь мы обнаружили, что длинная некодирующая РНК (днРНК) аспартил-тРНК-синтетазная антисмысловая РНК 1 (DARS-AS1) непосредственно участвует в ингибировании пути PACT-PKR и способствует пролиферации раковых клеток.Используя крупномасштабный функциональный скрининг ассоциированной с раком lncRNA CRISPRi 971, мы обнаружили, что DARS-AS1 был связан со значительно усиленной пролиферацией раковых клеток.Следовательно, нокаут DARS-AS1 ингибирует клеточную пролиферацию и способствует апоптозу раковых клеток в различных линиях раковых клеток in vitro и значительно снижает рост опухоли in vivo.Механически DARS-AS1 связывается непосредственно с доменом активации PACT и предотвращает взаимодействие PACT-PKR, тем самым снижая активацию PKR, фосфорилирование eIF2α и ингибируя апоптозную гибель клеток.Клинически DARS-AS1 широко экспрессируется при множественных опухолях, а сверхэкспрессия этой днРНК свидетельствует о плохом прогнозе.Это исследование выясняет специфическую для рака регуляцию пути PACT-PKR с помощью днРНК DARS-AS1 и обеспечивает еще одну цель для прогнозирования и лечения рака.
Способность адаптироваться к стрессу является важной характеристикой выживания и пролиферации раковых клеток.Быстрая пролиферация и метаболические признаки рака достигают пика в суровых микросредах — лишении питательных веществ, гипоксии и низком pH — которые могут запускать сигнальные пути гибели клеток.Нарушение регуляции чувствительных к стрессу генов, таких как p535, белки теплового шока 6, 7, KRAS8, 9 и HIF-110, 11, 12, 13, часто наблюдается при раке, тем самым блокируя апоптоз и способствуя выживанию.
Протеинкиназа R (PKR) является важным сенсором стресса и субъединичной киназой эукариотического фактора инициации 2α (eIF2α), трансляционного регулятора, который связывает клеточный стресс с гибелью клеток.Первоначально PKR был идентифицирован как противовирусный белок путем обнаружения чужеродной двухцепочечной РНК (дцРНК).При активации PKR фосфорилирует eIF2α, чтобы ингибировать синтез вирусных и клеточных белков14,15,16.PACT (белок-активатор PKR) был идентифицирован как первый белок-активатор PKR в отсутствие дцРНК17,18,19,20,21,22,23.Благодаря прямому взаимодействию с PKR, PACT трансдуцирует различные стрессы (сывороточное голодание, обработка пероксидом или арсенитом) на PKR и нижележащие сигнальные пути.В дополнение к фосфорилированию eIF2α, PACT-опосредованная активация PKR запускает различные события, связанные с реакцией на стресс, в том числе измененный окислительно-восстановительный статус через путь PI3K/Akt24, усиленную проверку повреждений ДНК через p5325,26 и NF-κB27,28 Регулирует транскрипцию,29. Учитывая их критическую роль в реакции на стресс, пролиферации, апоптозе и других ключевых клеточных процессах, PKR и PACT являются многообещающими терапевтическими мишенями для многих заболеваний, особенно рака30,31,32,33.Однако, несмотря на эту плейотропную функциональную и биологическую значимость, регуляция активности PACT/PKR в раковых клетках остается неуловимой.
lncRNAs представляют собой транскрипты размером более 200 нуклеотидов без потенциала кодирования белка.С тех пор, как передовые проекты секвенирования всего генома выявили тысячи lncRNAs,35,36 было предпринято много усилий для выяснения их биологических функций.Растущий объем исследований показал, что lncRNAs участвуют во многих биологических процессах37, включая регуляцию инактивации Х-хромосомы38,39, импринтинг40, транскрипцию41,42, трансляцию43 и даже рост рака44,45,46,47.В этих исследованиях сообщалось, что многие lncRNAs участвуют в пути PACT/PKR.Одно из таких исследований показало, что lncRNA ASPACT ингибирует транскрипцию PACT и увеличивает удержание в ядре мРНК PACT.Другие исследования показали, что lncRNA nc886 связывается с PKR и ингибирует ее фосфорилирование49,50.До сих пор не сообщалось о днРНК, регулирующей PACT-опосредованную активацию PKR.
Антисмысловая РНК 1 аспартил-тРНК-синтетазы (DARS-AS1) была идентифицирована как онкогенная днРНК51,52,53,54.Было показано, что посредством регуляции miP-194-5p53, miP-12952 и miP-532-3p51 DARS-AS1 способствует росту светлоклеточной почечно-клеточной карциномы, карциномы щитовидной железы и немелкоклеточной карциномы легкого соответственно.Тонг и его коллеги также обнаружили, что DARS-AS1 способствует прогрессированию миеломы за счет поддержания стабильности РНК-связывающего мотива белка 39 (RBM39).Однако не проводилось исследований того, участвует ли эта днРНК в регуляции активации PACT-PKR и реакции раковых клеток на стресс.
Здесь мы провели крупномасштабный скрининг потери функции с использованием системы CRISPRi и определили, что днРНК DARS-AS1 способствует пролиферации нескольких типов раковых клеток.Кроме того, мы определили основной механизм: DARS-AS1 связывается непосредственно с PACT, ингибирует связывание PACT и PKR, предотвращает фосфорилирование eIF2α, более низкого субстрата PKR, и, в конечном итоге, ингибирует апоптозную гибель клеток.В заключение, наша работа показывает, что днРНК DARS-AS1 является регулятором пути PACT-PKR и потенциальной мишенью для лечения и прогнозирования рака.
Обширные исследования геномного профилирования выявили сотни lncRNAs, связанных с раком.Однако их функция остается в значительной степени неизвестной56.Чтобы идентифицировать многообещающие кандидаты lncRNA, участвующие в прогрессировании рака, мы провели скрининг потери функции на снижение пролиферации в клеточной линии колоректального рака SW620 с использованием системы CRISPRi (рис. 1a).Уникальной особенностью клеточных линий рака толстой кишки SW480 и SW620 является то, что они получены из первичной и вторичной опухолей у одного пациента.Это дает ценное сравнение для изучения генетических изменений при прогрессировании прогрессирующего рака толстой кишки.Поэтому мы проанализировали транскриптомы клеточных линий колоректального рака (SW480 и SW620) с использованием секвенирования РНК и собрали некоторые потенциальные функциональные днРНК из опубликованной литературы.Основываясь на этих результатах, мы разработали объединенную библиотеку sgRNA, содержащую 7355 олигонуклеотидов sgRNA, нацеленных на 971 ассоциированную с раком lncRNA, и 500 нецелевых олигонуклеотидов sgRNA для отрицательного контроля (дополнительные данные 1).
Схематическое изображение скрининга с использованием системы CRISPRi.b обогащение sgRNA после скрининга.Горизонтальная пунктирная линия представляет log2 (кратное изменение) = ±0,58.Вертикальная пунктирная линия указывает значение p = 0,05.Черные точки представляют нецелевую sgRNA (обозначенную как NC).Красные точки — это sgRNA, нацеленные на DARS-AS1.Синие точки — это sgRNA, нацеленные на LINC00205, ранее описанную онкогенную lncRNA.кратное изменение = (нормализованное значение, 17-й день)/(нормализованное значение, 0-й день).c Нокдаун sgRNA DARS-AS1 ингибировал рост клеток.Столбики погрешностей представляют ± стандартное отклонение трех экспериментов.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 двусторонний критерий Стьюдента.d Экспрессия DARS-AS1 в опухолях (набор данных TCGA).em Экспрессия DARS-AS1 в парных нормальных и опухолевых образцах пациентов с BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP и COAD соответственно (набор данных TCGA).р-значения были получены с использованием парного двустороннего критерия Стьюдента.
После конструирования плазмиды и упаковки лентивируса мы трансдуцировали клеточную линию колоректального рака dCas9-SW620 вышеуказанной библиотекой в ​​четырех независимых экспериментах по заражению.Множественность заражения (MOI) для этих инфекций составляла 0,1–0,3, что указывает на то, что каждая клетка может быть трансфицирована только одной sgRNA.После 18 дней культивирования in vitro профиль обогащения sgRNA-мишенями уменьшался или увеличивался после скрининга, в то время как количество нецелевых контрольных олигонуклеотидов оставалось относительно неизменным по сравнению с профилем до скрининга, что указывает на то, что наша мишень обладает высокой специфичностью для скрининга. библиотека.Рис.1b и дополнительную таблицу 1). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис. 1b). LINC00205, о чем ранее сообщалось, что он имеет большое прогрессирование рака легких и рака печени58, 59, 60, была вероятность (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что существует вероятность этого скрининга (рис 1б). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис. 1b). . Linc00205 之前 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 进展 58,59,60 ， 筛 选 掉 掉 （（（进展 进展 倍数 变化 变化) <-0,58 ， p 值 <0,05) ， 了 该 筛选 可靠性 （图 1B）。。 证实 筛选 筛选 可靠性 Linc00205 之前 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 进展 58,59,60 ， 筛 选 掉 掉 （（（进展 进展 倍数 变化 变化) <-0,58 ， p 值 <0,05) ， 了 该 筛选 可靠性 （图 1B）。。 证实 筛选 筛选 可靠性 LINC00205, о чем ранее сообщалось, что он увеличивает прогрессирование рака легких и печени58, 59, 60, была вероятность (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что существует вероятность этого скрининга (рис 1б). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис. 1b).
Среди всех протестированных lncRNAs DARS-AS1 также был подвергнут скринингу, при этом три родственных олигонуклеотида sgRNA значительно уменьшились после 18 дней культивирования, что позволяет предположить, что нокдаун этой lncRNA привел к снижению пролиферации рака (рис. 1b).Этот результат был дополнительно подтвержден анализом MTS в клетках колоректального рака, показывающим, что скорость роста клеток с нокдауном DARS-AS1 была только вдвое ниже по сравнению с контрольными клетками (рис. 1c) и согласовывалась с предыдущими сообщениями о нескольких других типах рака.: светлоклеточный рак почки, рак щитовидной железы и немелкоклеточный рак легкого51,52,53,55.Однако его функция и молекулярные механизмы при колоректальном раке остаются неизученными.Поэтому мы выбрали эту днРНК для дальнейшего изучения.
Чтобы изучить экспрессию DARS-AS1 у пациентов, мы всесторонне проанализировали 10 327 образцов опухолей из проекта «Атлас генома рака» (TCGA).Наши результаты показывают, что DARS-AS1 широко экспрессируется и значительно активируется в здоровых клетках при различных опухолях, включая аденокарциному толстой кишки (COAD), почечную светлоклеточную карциному (KIRC) и почечно-папиллярно-клеточную карциному (KIRP)..Очень мало (рис. 1d и дополнительные рис. 1a, b). Анализ парных здоровых/опухолевых образцов также подтвердил значительно более высокую экспрессию DARS-AS1 в опухолях уротелиальной карциномы мочевого пузыря (BLCA), светлоклеточной карциномы почки и почки (KIRC), аденокарциномы предстательной железы (PRAD), плоскоклеточной карциномы легкого (LUSC). , карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e–m) . Анализ парных здоровых/опухолевых образцов также подтвердил значительно более высокую экспрессию DARS-AS1 в опухолях уротелиальной карциномы мочевого пузыря (BLCA), светлоклеточной карциномы почки и почки (KIRC), аденокарциномы предстательной железы (PRAD), плоскоклеточной карциномы легкого (LUSC). , карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e–m) .Анализ парных здоровых/опухолевых образцов также подтвердил значительно более высокую экспрессию DARS-AS1 при уротелиальной карциноме мочевого пузыря (BLCA), светлоклеточной почечной и почечно-клеточной карциноме (KIRC), аденокарциноме предстательной железы (PRAD), плоскоклеточной карциноме легкого (LUSC) опухоли., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– м) . , эндометриальная карцинома тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p < 0,05) (рис. 1д–м).配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 了 了 了 了 as1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 (blca) 、 肾 肾 透明 细胞癌 (kirc) 、 前列 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 (lusc) 肿瘤 中 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高 ， 子宫体子宫 内膜 癌 癌 （（ucec） ， 肺腺癌 （（） 肝肝 细胞癌 细胞癌 （（（（， 肾 乳头状 细胞癌 细胞癌 （k 和结肠腺癌 和结肠腺癌 和结肠腺癌 (Coad) (P 值 值<0,05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 了 了 了 了 肾 细胞癌 在 上 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (Prad) 、 细胞癌 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 更 高 表达 ， ， 癌 （（（（） 肺腺癌 （） 细胞癌 细胞癌 （（） 乳头状 乳头状 细胞 细胞 细胞 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Анализ парных образцов здоровых/опухолевых также подтвердил роль DARS-AS1 в уротелиальной карциноме мочевого пузыря (BLCA), светлоклеточной почечно-клеточной карциноме (KIRC), аденокарциноме предстательной железы (PRAD) и плоскоклеточной карциноме легкого (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -м). экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e-m).В совокупности эти результаты показывают, что DARS-AS1 широко и высоко экспрессируется при различных видах рака.
Поскольку DARS-AS1 и DARS (ген, кодирующий антисмысловую цепь) имеют один и тот же промотор и расположены рядом друг с другом, мы разработали кшРНК для специфического нокдауна DARS-AS1, но не DARS (дополнительные рис. 2a, b и дополнительная таблица 2). .В дополнение к SW620 мы также использовали три другие клеточные линии, высоко экспрессирующие DARS-AS1, для изучения эффективности и функции нокдауна кшРНК (дополнительная таблица 3).Наши результаты показали, что все три разработанные кшРНК достигли не менее 80% эффективности нокдауна DARS-AS1 с небольшим влиянием на количество мРНК DARS (дополнительная рис. 2c – f).Кроме того, мы обнаружили, что нокдаун DARS-AS1 с помощью этих кшРНК значительно ингибировал рост клеток в клеточных линиях колоректального рака SW620 (49,7%) и HCT116 (27,7%), клеточной линии рака молочной железы MBA-MD-231 (53,4%).) и клеточной линии гепатомы HepG2 (снижение на 92,7%), а также их способность образовывать незакрепленные сферы (снижение в среднем ~50,8%, 44,6%, 40,7% и 75,7% на клеточную линию) (рис. 2а, б).В SW620 результаты анализа образования колоний дополнительно подтвердили, что кшРНК DARS-AS1 значительно ингибировала пролиферацию клеток со средним снижением примерно на 69,6% (рис. 2c).
Влияние контрольной кшРНК и кшРНК DARS-AS1 на пролиферацию клеток (а) и образование сфероидов (б) в клетках SW620, HCT116, MBA-MD-231 и HepG2.c Влияние контрольной кшРНК и кшРНК DARS-AS1 на образование колоний в клетках SW620.Пролиферация клеток (d), образование сфероидов (e) и образование колоний (f) клеток SW620, сверхэкспрессирующих DARS-AS1.Показанные данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение трех экспериментов.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 и *** p ≤ 0,001 по двустороннему критерию Стьюдента.
Чтобы дополнить исследования потери функции, мы затем создали клетки SW620, сверхэкспрессирующие DARS-AS1 (дополнительная рис. 2g).Сверхэкспрессия DARS-AS1 значительно увеличивала рост клеток (в 1,8 раза), образование незаякоренных сфероидов (в 1,4 раза) и образование колоний (в 3,3 раза) в клетках SW620 (рис. 2d – f).Мы подтвердили этот результат, используя другую клеточную линию, экспрессирующую DARS-AS1, A549.Эта усиленная пролиферация клеток из-за сверхэкспрессии DARS-AS1 далее наблюдалась в клетках A549 (дополнительная рис. 2h, i и дополнительная таблица 3).В совокупности эти исследования усиления и потери демонстрируют, что DARS-AS1 способствует пролиферации раковых клеток in vitro.
Чтобы изучить лежащий в основе механизм, с помощью которого DARS-AS1 регулирует пролиферацию клеток, мы провели анализ вытягивания РНК, чтобы определить его потенциальных партнеров по связыванию с белками.Результаты RT-qPCR показали, что около 86,2% DARS-AS1 находится в цитоплазме клеток SW620 (дополнительная рис. 3a).Транскрибированный in vitro биотинилированный DARS-AS1 или псевдоРНК затем инкубировали с лизатами клеток SW620 с последующим разделением в SDS-PAGE.Последующее окрашивание серебром показало, что отчетливая полоса (~ 38 кДа) была значительно обогащена в образцах извлечения DARS-AS1, но не в образцах фиктивной РНК или гранул (рис. 3а).Эта полоса была идентифицирована как PKR-активирующий белок (PACT) с помощью масс-спектрометрии (МС) и дополнительно подтверждена иммуноблоттингом в клеточных линиях SW620, HCT116 и HepG2 (рис. 3a, b).Обогащение DARS и родственными белками PACT – PKR и TRBP – также исследовали с помощью анализа РНК методом вестерн-блоттинга (WB).Результаты показали, что прямого взаимодействия между РНК DARS-AS1 и этими тремя белками обнаружено не было (дополнительная рис. 3b).Специфическое взаимодействие между DARS-AS1 и PACT было дополнительно подтверждено анализом иммунопреципитации РНК (RIP), который показал, что DARS-AS1 был значительно обогащен антителами против PACT, но не другими контрольными РНК (рис. 3c).Чтобы определить, взаимодействует ли DARS-AS1 напрямую с PACT в отсутствие каких-либо других клеточных компонентов, был проведен анализ биослойной интерферометрии (BLI) in vitro с использованием очищенного PACT.Меченый биотином DARS-AS1 или фиктивную РНК иммобилизовали на стрептавидиновых (SA) биосенсорах, а затем инкубировали в кинетическом буфере, содержащем 1 мкМ PACT.Примечательно, что PACT сильно связывался с DARS-AS1 (значение KD ~ 26,9 нМ), но не с имитацией РНК (рис. 3d).В совокупности эти результаты демонстрируют прямое взаимодействие и высокую аффинность между DARS-AS1 и PACT.
Анализ вытягивания РНК идентифицировал DARS-AS1, взаимодействующий с PACT в клетках SW620.Вверху: окрашивание родственных белков серебром.Нижние иммуноблоты были выполнены с антителом против PACT.b Анализ вытягивания РНК проводили в клетках HCT116 (вверху) и HepG2 (внизу).Обогащение PACT выявляли с помощью иммуноблоттинга.Анализы иммунопреципитации кРНК (RIP) проводили в клетках SW620 с использованием указанных антител.d Кривые связывания PACT с полноразмерным DARS-AS1 или контрольной РНК были получены с использованием биослойной интерферометрии (BLI).РНК иммобилизовали на стрептавидиновом биосенсоре.1 мкМ PACT использовали для измерения ассоциации.e Анализ вытягивания РНК проводили с использованием биотинилированного полноразмерного DARS-AS1 или укороченного (вверху).Иммуноблот, показывающий полученный PACT (внизу).f Очищенный помеченный PACT инкубировали с биотинилированным полноразмерным DARS-AS1 или укороченным (как в e) для анализа RIP in vitro.Экстрагированную РНК проверяли с помощью RT-qPCR.g Относительная аффинность различных фрагментов РНК к PACT была получена с использованием интерферометрии биослоя.Для анализа использовали 100 нМ РНК и 1 мкМ RAST.h Анализы RIP in vitro проводили с использованием очищенного интактного или укороченного меченого PACT.Экстрагированную РНК проверяли с помощью RT-qPCR.i Скорость роста клеток SW620 со сверхэкспрессией DARS-AS1, PACT или того и другого.j Сверхэкспрессия полноразмерного или укороченного DARS-AS1 в клетках SW620 по-разному влияла на рост клеток.k Апоптоз выявляли с помощью иммуноблоттинга с антителом против PARP.l Нокаут DARS-AS1 индуцирует апоптоз клеток SW620, как показано с помощью проточной цитометрии.Показанные данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение трех экспериментов. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента.
Затем мы создали три биотинилированных фрагмента РНК DARS-AS1 с помощью транскрипции in vitro, чтобы идентифицировать область DARS-AS1, необходимую для ассоциации PACT (рис. 3e).Результаты анализа РНК показали, что каждый фрагмент способен взаимодействовать с PACT, но в 3'-концевой области (384–768 нуклеотидов, помеченных А3) обнаружено более 1–384 нуклеотидов, помеченных А1) (рис. 3д).Аналогичные результаты наблюдались в анализе RIP in vitro с использованием рекомбинантного PACT (рис. 3f).В соответствии с этими результатами эксперименты по связыванию иммобилизованных фрагментов РНК с PACT с использованием BLI также показали, что PACT имеет более высокое сродство к A3 (384–768 н.) (значение KD примерно 94,6 нМ), в то время как почти не связывается с другими областями.(рис. 3г).
Мы также исследовали связанные области связывания в PACT.PACT содержит три функциональных домена, два из которых представляют собой консервативные двухцепочечные РНК-связывающие домены (dsRBD) и третий домен (обозначенный D3), который действует как активатор белковых взаимодействий.Чтобы изучить способность связывания днРНК каждого домена, мы разработали три мутации, которые удалили каждый из трех доменов, и провели анализ RIP in vitro.Наши результаты показали, что делеция третьего домена (D3) PACT значительно снижала его взаимодействие с DARS-AS1 (в 0,11 раза по сравнению с интактным PACT) по сравнению с двумя другими мутациями (рис. 3з), было показано, что высвобождение D3 взаимодействовал с DARS.-АС1.В совокупности эти результаты позволяют предположить, что взаимодействие между DARS-AS1 и PACT может происходить главным образом через 3'-конец DARS-AS1 и домен D3 PACT.
Мы отметили, что DARS-AS1 не влиял на экспрессию PACT, а PACT не влиял на DARS-AS1 (дополнительная рис. 3c).Затем мы исследовали влияние нокдауна PACT на рост клеток.В отличие от DARS-AS1, относительные клетки росли в 1,5–3 раза быстрее, когда PACT был сбит (дополнительная рис. 3d).Результаты анализа образования колоний показали, что клетки образовывали 2-3-кратные колонии после обработки кшРНК с помощью PACT (дополнительная рис. 3e).Чтобы проверить, регулирует ли DARS-AS1 пролиферацию клеток посредством PACT, мы создали клетки SW620, сверхэкспрессирующие PACT, DARS-AS1 или оба.Сверхэкспрессия PACT показала значительное ингибирование пролиферации клеток (рис. 3i).В то время как сверхэкспрессия DARS-AS1 сама по себе значительно способствовала пролиферации клеток, не было существенной разницы в скорости роста клеток, сверхэкспрессирующих DARS-AS1 и PACT.Эти результаты позволяют предположить, что PACT может противодействовать повышенной пролиферации, вызванной гиперэкспрессией DARS-AS1.
Поскольку разные области DARS-AS1 обладают разной способностью связывать PACT, мы исследовали их относительное влияние на пролиферацию клеток с помощью различной сверхэкспрессии фрагментов DARS-AS1.По сравнению с двумя другими фрагментами DARS-AS1 был сверхэкспрессирован на 3'-конце (384–768 н.), основной области, связанной с PACT в DARS-AS1, которая обладала наибольшей способностью стимулировать клеточную пролиферацию (рис. 3j).Эти результаты указывают на положительную корреляцию между связывающей способностью и биологической функцией DARS-AS1.
Сообщалось, что PACT является проапоптотическим белком19.Поэтому мы исследовали влияние DARS-AS1 на апоптоз.Как и ожидалось, нокдаун DARS-AS1 значительно увеличивал расщепление PARP в клетках SW620 и увеличивал долю аннексина V-позитивных клеток в клеточных линиях SW620, HCT116, HepG2 и MBA-MD-231 (рис. 3k).3).3f–h), что указывает на то, что антиапоптотический эффект DARS-AS1 в раковых клетках противоположен апоптоз-индуцирующей функции PACT.В совокупности эти результаты позволяют предположить, что механизм онкогенной функции DARS-AS1 может заключаться в ингибировании функции PACT.
Затем мы исследовали функциональные последствия ассоциации DARS-AS1-PACT.Сообщалось, что PACT активирует PKR посредством прямого взаимодействия, что впоследствии усиливает фосфорилирование eIF2α, вызывая делецию трансляции и апоптоз17.Во-первых, мы исследовали, влияет ли DARS-AS1 на клеточную локализацию PACT и PKR.Конфокальная флуоресцентная микроскопия показала, что PACT и PKR были сильно колокализованы в клетках SW620 со средним коэффициентом корреляции Пирсона 0,72.Между тем, сверхэкспрессия DARS-AS1 значительно снижала совместную локализацию PACT и PKR (средний коэффициент корреляции Пирсона 0,61) (рис. 4а).Чтобы выяснить, может ли DARS-AS1 модулировать взаимодействие PACT-PKR, мы провели анализ ко-иммунопреципитации (co-IP) с антителом против PACT в клеточных лизатах SW620.PKR был сильно обогащен анти-PACT в контрольных клетках, в то время как восстановление PKR было значительно снижено в лизатах из клеток, сверхэкспрессирующих DARS-AS1 (фиг. 4b).Очищенные меченые PACT и PKR использовали для анализов связывания белков in vitro.Соответственно, те, которые обеспечивали DARS-AS1, но не имели контрольной РНК, демонстрировали подавленное взаимодействие PACT-PKR (рис. 4c).Все результаты показали, что DARS-AS1 нарушал связь PACT и PKR.
a Совместную локализацию PACT и PKR в контрольных клетках или клетках, сверхэкспрессирующих DARS-AS1, наблюдали с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии.Ядра окрашивали DAPI.Статистические результаты были получены по 16 фотографиям.b Коиммунопреципитация (ко-IP) с использованием антитела против PACT в клеточных лизатах контрольных клеток SW620 или клеток, сверхэкспрессирующих DARS-AS1.c Меченый PACT, очищенный PKR и транскрибированный in vitro с помощью DARS-AS1 или фиктивной РНК инкубировали для анализа связывания белка in vitro.Для иммунопреципитации использовали антитела к флагу.d Иммуноблоты с указанными антителами проводили в клетках SW620 и HCT116, трансфицированных контрольной кшРНК или DARS-AS1-кшРНК с последующим голоданием по сыворотке.e Уровни экспрессии DARS-AS1 изменяли чувствительность клеток к тапсигаргину.Клетки SW620 трансфицировали кшРНК DARS-AS1, плазмидой сверхэкспрессии DARS-AS1 или контрольной плазмидой.Клетки обрабатывали тапсигаргином в течение 48 часов и определяли жизнеспособность клеток с использованием реагента MTS.f In vitro транскрибированный DARS-AS1 или фиктивную РНК и очищенный PACT использовали для анализа активации in vitro и обнаружения с помощью иммуноблота.g Иммуноблоты с использованием этих антител проводили на клетках SW620-ctrl (слева) или клетках, сверхэкспрессирующих мутанты PKR (справа).Затем эти клетки трансфицировали контрольной кшРНК или DARS-AS1-кшРНК с последующим лишением сыворотки.h Проточная цитометрия показала, что инактивация мутантной PKR компенсировала индуцируемый DARS-AS1 апоптоз в клетках SW620.i Иммуноблоты с указанными антителами проводили в клетках SW620 (слева) или HCT116 (справа).Клетки, трансфицированные контрольной кшРНК или кшРНК DARS-AS1, лишены сыворотки и дополнены 100 нМ ингибитора PKR C16 или ДМСО.Масштабная линейка = 5 мкм.Показанные данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение трех экспериментов.* p ≤ 0,05 двусторонний критерий Стьюдента.
Обычно считается, что как только PACT взаимодействует с PKR17, может быть индуцировано фосфорилирование PKR по Thr451.Наши результаты показали, что уровень фосфорилирования PKR был значительно повышен в клетках с нокдауном DARS-AS1 после голодания в сыворотке (рис. 4d и дополнительная рис. 4a).Соответственно, мы обнаружили, что фосфорилирование eIF2α, основного субстрата PKR, также значительно увеличивалось с помощью кшРНК DARS-AS1 (рис. 4d и дополнительная рис. 4a).Тапсигаргин является стрессором ER, который заставляет ER высвобождать Ca2+.Сообщалось, что лечение тапсигаргином индуцирует экспрессию и активацию PACT, который в дальнейшем взаимодействует с PKR и активирует его, приводя к апоптозу за счет увеличения фосфорилирования eIF2α 18,61 .Здесь мы использовали тапсигаргин в качестве стимулятора пути PACT/PKR, чтобы выяснить, может ли DARS-AS1 помочь клеткам преодолеть стресс путем ингибирования пути PACT/PKR.Мы наблюдали, что уровень экспрессии DARS-AS1 положительно коррелировал с устойчивостью клеток к тапсигаргину.Клетки SW620 со сверхэкспрессией DARS-AS1 выживали лучше при обработке тапсигаргином, в то время как клетки с нокдауном DARS-AS1 становились более восприимчивыми (рис. 4д).В соответствии с этими результатами сверхэкспрессия DARS-AS1 снижала индуцированное тапсигаргином фосфорилирование PKR (дополнительная рис. 4b).Напротив, после обработки тапсигаргином PKR и eIF2α фосфорилировались в большей степени в клетках с нокдауном DARS-AS1 по сравнению с контрольными клетками (дополнительная рис. 4b).Интересно, что тапсигаргин индуцировал экспрессию DARS-AS1 дозозависимым образом, что может указывать на антистрессовую функцию DARS-AS1 (дополнительная рис. 4c).Кроме того, мы провели анализы активации in vitro, чтобы подтвердить эти наблюдения.Вкратце, PKR очищали из клеточных лизатов с использованием антитела против PKR, затем инкубировали с рекомбинантным PACT и DARS-AS1, транскрибированными in vitro.После ферментативной реакции фосфо-PKR выявляли с помощью WB.Наши результаты показали, что фосфорилирование PKR значительно ингибировалось DARS-AS1, но не контрольной РНК (рис. 4f).Эти результаты in vitro и in vivo позволяют предположить, что DARS-AS1 ингибирует PACT-опосредованную активацию PKR.В то же время мы также наблюдали снижение восстановления PACT в присутствии DARS-AS1 (рис. 4f).Этот результат согласуется с результатами анализа связывания белка in vitro (рис. 4c) и снова иллюстрирует блокирующую функцию DARS-AS1 для ассоциации PACT-PKR.
Ser246 и Ser287 в домене D3 PACT необходимы для активации PKR при клеточном стрессе.Замена двух остатков серина на аланин давала мутантный PACT (mutD), который активировал PKR в отсутствие стресса, а замена на аланин (mutA) обращала протокол.Поскольку мы продемонстрировали важность этого домена в прямой связи с DARS-AS1, мы создали эти два мутанта PACT, чтобы проверить, могут ли эти остатки также участвовать во взаимодействии с DARS-AS1.Интересно, что оба мутанта утратили способность связываться с DARS-AS1 (дополнительная рис. 4d), что позволяет предположить, что для эффективного взаимодействия с DARS-AS1 может потребоваться полная структура белка PACT.
Кроме того, наши результаты также показывают, что DARS-AS1-shRNA-индуцированное ингибирование пролиферации клеток может быть частично восстановлено за счет сверхэкспрессии доминантно-негативного мутанта PACT (PACTmutA) или доминантно-негативного мутанта PKR (PKRmut) (дополнительная рис. 4e. e).Сверхэкспрессия доминантно-негативных мутантов PKR снижала фосфорилирование PKR, индуцированное нокдауном DARS-AS1, а также фосфорилирование eIF2α в клетках, лишенных сыворотки (рис. 4g).Что еще более важно, доля апоптотических клеток, индуцированных нокдауном DARS-AS1, также была снижена в клетках, сверхэкспрессирующих PKRmut (рис. 4h и дополнительная рис. 4g).Ингибирование активности киназы PKR также ухудшает функцию DARS-AS1, поскольку результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 редко запускал фосфорилирование PKR и eIF2α, когда клетки обрабатывали специфичным для PKR ингибитором C16 (рис. 4i и дополнительная рис. 4h).).В совокупности наши результаты свидетельствуют о том, что DARS-AS1 способствует пролиферации клеток, по крайней мере частично, путем ингибирования PACT-опосредованной активации PKR.
Для дальнейшего изучения роли DARS-AS1 в онкогенезе мы провели эксперименты in vivo с использованием модели ксенотрансплантата мыши. Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Результаты, что нокдаун DARS-AS1 резко выраженный рост роста у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p<0.0001）（图5a）。 Результаты измерения значительного нокдаун DARS-AS1 значительного роста роста у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижал рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а).Таким образом, в группе с нокдауном DARS-AS1 наблюдалось значительное уменьшение среднего объема опухоли примерно на 72,9% и средней массы опухоли примерно на 87,8% (рис. 5b-d).Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что DARS-AS1 может значительно способствовать росту опухоли in vivo.
Эффекты нокдауна ad DARS-AS1 на колоректальный онкогенез у голых мышей.Показаны кривые роста (а), размер опухоли (б), вес (в) и изображения опухоли (г).Столбики погрешностей представляют собой ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 двусторонний критерий Стьюдента.п = 10. ****p < 0,0001, 通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001, 通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 двусторонний критерий Стьюдента.e Каплан-Мейер проанализировал корреляцию между уровнями экспрессии DARS-AS1 и общей выживаемостью у пациентов с UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM и LGG.Высокий уровень экспрессии DARS-AS1 у пациентов был в верхних 50%;низкий уровень экспрессии DARS-AS1 у пациентов находился в нижних 50%.p-значения были определены с использованием логарифмического рангового теста.f Предлагаемая модель, в которой DARS-AS1 регулирует путь PACT-PKR и рост опухоли.
Чтобы лучше понять клиническое влияние DARS-AS1, мы изучили корреляцию между его экспрессией и выживаемостью пациентов.Анализируя набор данных TCGA, мы обнаружили, что более высокая экспрессия DARS-AS1 была связана с увеальной меланомой (UVM), почечной хромофобией (KICH), почечной папиллярно-клеточной карциномой (KIRP), мезотелиомой (MESO), мультиплексом.Более низкая выживаемость была в значительной степени связана с морфозом глиобластомы (GBM) и пациентами с глиомой головного мозга низкой степени (LGG) (рис. 5e).Эти результаты свидетельствуют о том, что DARS-AS1 может играть важную роль в клиническом прогрессировании опухоли и может быть потенциальным прогностическим биомаркером множественных видов рака.
В этом исследовании, используя крупномасштабный функциональный скрининг CRISPRi, мы определили, что днРНК DARS-AS1 преодолевает стресс раковых клеток, регулируя два ключевых стресс-ответчика, PACT и PKR.Взаимодействуя непосредственно с PACT, DARS-AS1 ингибировал PACT-опосредованную активацию PKR, тем самым предотвращая апоптозную гибель клеток и способствуя клеточной пролиферации (Fig. 5f).Повышенная регуляция DARS-AS1 наблюдалась при многих типах рака, что позволяет предположить, что его функция, способствующая выживанию раковых клеток в стрессовых условиях, может быть широко применима к нескольким типам рака.
PACT был идентифицирован как белок-активатор PKR, и PACT-опосредованная активация PKR играет важную роль в реакциях на стресс, регулируя транскрипцию, трансляцию, апоптоз и другие важные клеточные процессы62.На протяжении десятилетий предпринимались попытки понять специфическую для рака регуляцию каскада PACT-PKR.Здесь наше исследование выявило другой механизм регуляции PACT-PKR в раковых клетках через клеточную днРНК DARS-AS1, которая напрямую связывается с PACT, блокирует взаимодействие PACT-PKR, ингибирует активацию PKR и фосфорилирование eIF2α, тем самым ингибируя индуцированный стрессом апоптоз и стимулируя возможную пролиферацию рака.клетки.Это открытие проливает свет на потенциальные мишени lncRNA для прогнозирования и лечения рака.
Наши данные показали, что нокдаун DARS-AS1 сенсибилизирует клетки к голоданию сыворотки со значительным увеличением фосфорилированных PKR и eIF2α.Эти результаты свидетельствуют о том, что DARS-AS1 способствует выживанию раковых клеток в суровых условиях путем ингибирования активности PACT/PKR.Некоторые другие некодирующие РНК, такие как ASPACT и nc886, также участвуют в оси PACT/PKR, подавляя мРНК PACT48 или регулируя аутофосфорилирование путем связывания с PKR49,50,64.Среди них DARS-AS1 действует как разрушитель ассоциации PACT-PKR.Это исследование обогащает наше понимание регуляции оси PACT/PKR и роли lncRNAs в реакциях на стресс.
PACT содержит три отдельных домена.Каждый из первых двух dsRBD достаточен для достижения высокоаффинного связывания PACT с PKR, в то время как третий домен (D3) необходим для активации PKR in vitro и in vivo.Наше исследование показало, что DARS-AS1 преимущественно взаимодействует с доменом D3 (рис. 3з).Учитывая большой размер lncRNA (768 нуклеотидов), связывание DARS-AS1 с D3 может физически ингибировать взаимодействие между доменом PACT dsRBD и PKR, тем самым блокируя ассоциацию PACT и PKR.Точечные мутации PACT, которые заменили Ser246 и Ser287 в D3 на аланин или аспартат, нарушили его аффинность связывания с DARS-AS1, указывая на важность общих структурных и электрических свойств D3 в их ассоциации.В будущем потребуются дополнительные детали этого механизма с использованием более точного биохимического анализа и структурного анализа PACT с высоким разрешением.
Предыдущие исследования показали, что DARS-AS1 способствует пролиферации клеток с помощью нескольких механизмов51,52,53.В одном примере исследователи наблюдали, что DARS-AS1 активировал свой ген DARS, кодирующий антисмысловой белок, путем нацеливания на miP-194-5p в клетках рака почки.Однако в настоящем исследовании нокдаун DARS-AS1 мало влиял на транскрипцию DARS при множественных типах рака, включая, по крайней мере, колоректальный рак, рак молочной железы и рак печени.Поскольку lncRNAs демонстрируют клеточно- и тканеспецифические паттерны экспрессии, функциональные механизмы могут не сохраняться для разных типов рака, что может способствовать этому несоответствию между нашими наблюдениями и предыдущими оценками различных видов рака.Необходимы специальные исследования для выяснения конкретных механизмов различных физиологических и патологических процессов.
Анализ клинических данных показал, что экспрессия DARS-AS1 в опухолях обратно коррелирует с выживаемостью больных раком, что подчеркивает важность оси DARS-AS1/PACT/PKR в прогнозе рака.В заключение, наше исследование показывает, что DARS-AS1 является регулятором сигнальной оси PACT/PKR, способствует пролиферации раковых клеток и ингибирует апоптоз во время реакции на стресс, что обеспечивает еще одно направление исследований и представляет интерес для будущих исследований потенциальных методов лечения. .
Клеточные линии человека SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 и HEK293T были получены из Национальной инфраструктуры ресурсов клеточных линий в Китае.Все клетки поддерживали в среде DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) с добавлением 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) и 1% пенициллин-стрептомицина (Thermo Fisher Scientific) при 37°C, 5% CO2.инкубатор.
Анти-ПАКТ, Abcam (ab31967);Анти-PKR, Abcam (ab184257);Анти-PKR (фосфо-T451), Abcam (ab81303);Антифлаг, Abcam (ab125243);Анти-eIF2α, Abcam (A0764));анти-eIF2α (фосфор S51), Abcam (ab32157);анти-PACT (фосфор S246), Abgent (AP7744b);анти-β-тубулин, CST (2128);нормальный мышиный IgG, CST (5415S);нормальный кролик IgG, CST (2729S).Антитела разводили 1:1000 в PBST для вестерн-блоттинга и 1:100 для IP.
sgRNA были разработаны с использованием общедоступного инструмента под названием CRISPR-ERA66.Мы использовали параметры инструмента по умолчанию для разработки sgRNA, и алгоритм вычислил сайты связывания sgRNA в области 3 т.п.н.с центром в ТСС.Пулы олигонуклеотидов sgRNA были синтезированы в CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) и клонированы в гуманизированные плазмиды pgRNA (Addgene #44248).Всего 12 мкг объединенной гуманизированной плазмиды pgRNA, 7,2 мкг psPAX2 (Addgene #12260) и 4,8 мкг pMD2.G (Addgene #12259) совместно трансфицировали в 5 x 106 HEK293T в 10-сантиметровых чашках с использованием реагента для трансфекции DNAfect. ячейки (CWBIO, Пекин, Китай) в соответствии с инструкциями производителя.Вируссодержащие супернатанты собирали через 48 и 72 часа после трансфекции и фильтровали через фильтр 0,45 мкм.Для скрининга клетки SW620, экспрессирующие слитый белок dCas9/KRAB, получали путем трансдукции вируса.Модифицированные клетки SW620 инфицировали вирусной библиотекой в ​​четырех независимых экспериментах по заражению при MOI 0,1-0,3, и отбирали образцы с 2 мкг/мл пуромицина (Sigma, Сент-Луис, Миссури) в течение 2 дней.После этого клетки культивировали в течение 18 дней in vitro при минимальном покрытии библиотеки 500 клеток/sgRNA для скрининга.
Геномную ДНК экстрагировали в соответствии с инструкциями набора QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Дюссельдорф, Германия; 51183).Всего для создания библиотеки использовали 100 мкг геномной ДНК на биологический повтор.Область sgRNA амплифицировали двумя циклами ПЦР и связывали со штрих-кодом.
Продукты ПЦР очищали с использованием геля NucleoSpin® и набора для очистки ПЦР (MACHEREY-NAGEL, Дюрен, Германия; 740609.250) и количественно определяли с использованием набора для обнаружения двухцепочечной ДНК Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Анализ MTS использовали для измерения пролиферации клеток.Клетки высевали в 96-луночные планшеты при исходной плотности 2000 клеток/лунку.Относительное количество клеток измеряли ежедневно в указанное время в течение 4-6 дней.Для каждой лунки 20 мкл реагента MTS (Promega) разводили 100 мкл DMEM, инкубировали с клетками в течение 4 ч при 37°С, затем измеряли OD490.
Способность к незакрепленному росту была обнаружена путем анализа образования сфер.Вкратце, 2000 клеток, трансфицированных кшРНК DARS-AS1 или контрольной кшРНК, культивировали в микропланшетах со сверхнизким прикреплением (Corning) со сменой среды каждые 4 дня.Сфероиды подсчитывали через 14 дней.500 клеток, трансфицированных плазмидой сверхэкспрессии DARS-AS1 или контрольной плазмидой, использовали для анализа усиления, в остальном метод не изменился.
РНК транскрибировали с использованием РНК-полимеразы Т7 и биотин-16-UTP (Roche 1138908910) в соответствии с инструкциями Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Используемые здесь праймеры перечислены в дополнительной таблице 4.
Кодирующие белок области PACT или PKR клонировали в pET15b (Addgene #73619) и трансформировали в BL21(DE3).Бактерии инкубировали в течение ночи в LB, снабженном ампициллином, а затем разбавляли в 100 раз свежим LB.Когда OD600 среды достигала 0,8, добавляли 1 мМ IPTG для индукции экспрессии белка.После инкубации в течение ночи при осторожном встряхивании (250 об/мин при 20°С) осадок клеток собирали центрифугированием (4000 об/мин, 10 мин, 4°С).Ресуспендируют клеточный осадок в лизирующем буфере (50 мМ Трис, pH 8,0, 250 мМ NaCl, 1 мМ PMSF) и инкубируют на льду в течение 30 мин, затем обрабатывают ультразвуком (15 мин, 5 с вкл/выкл, на льду) и центрифугируют (13 000 об/мин). об/мин)., 30 мин, 4°С).Затем супернатант наносили на смолу Ni-NTA (QIAGEN) 3 раза при 4°C, промывали 4 раза промывочным буфером (50 мМ Трис, pH 8,0, 40 мМ имидазол, 250 мМ NaCl) и элюировали 3 раза, с общим 10 мл элюирующего буфера (50 мМ Трис, рН 8,0, 250 мМ NaCl, 300 мМ имидазол).Очищенный белок определяли с помощью WB, а концентрацию определяли с помощью набора для анализа белка Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Анализы RIP проводили, как описано ранее, с модификациями.Вкратце, 1x RIP-буфер (25 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 100 мМ NaCl, 0,5% NP-40, ингибитор рибонуклеазы RNasin (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 мМ DDM, протеаза) лизирует цитостатический коктейль 1 x 107 (Roche, 1 мМ DTT) и центрифугировать при 13000 об/мин в течение 15 мин при 4 °C.Затем супернатант инкубировали с магнитными гранулами белка A+G (Millipore), конъюгированными с 5 мкг антитела против PACT (Abeam) или IgG (CST).Гранулы 5 раз промывали 5x RIP-буфером, затем расщепляли протеиназой K (NEB).РНК экстрагировали тризолом и определяли с помощью RT-qPCR.Праймеры представлены в дополнительной таблице 5.
Анализ RIP in vitro проводили в соответствии с модифицированным стандартным протоколом анализа RIP.В общей сложности 5 пмоль транскрибированной in vitro РНК разбавляли 1x RIP-буфером и отжигали путем инкубации при 65°C в течение 5 минут с последующим медленным охлаждением до комнатной температуры.Всего из E. coli было очищено 5 пмоль интактных или мутированных меченых флагом белков PACT.Инкубируйте с ренатурированной РНК в течение 2 часов при 4°C и следуйте описанной выше процедуре анализа RIP на анти-flag IP.
Для анализа удлинения РНК 1×107 клеток лизировали буфером 1×RIP.После центрифугирования при 13000 об/мин в течение 15 мин при 4°С супернатант предварительно обрабатывали 30 мкл стрептавидиновых магнитных шариков (Beckman) в течение 2 ч при 4°С.Очищенный лизат затем снабжали дрожжевой тРНК и инкубировали с 40 пмоль ренатурированной РНК в течение ночи при 4°С, затем еще в течение 2 часов и добавляли 20 мкл новых стрептавидиновых магнитных шариков, блокированных БСА.Этап промывки состоял из 4 раз с 5x RIP-буфером и 4 раза с 1x RIP-буфером.Соответствующие белки элюировали биотиновым буфером для элюирования (25 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 мМ D-биотин, PMSF) и разделяли на NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).После окрашивания серебром (Beyotime Biotechnology) определенные полосы вырезали и анализировали с помощью МС.
Анализ Co-IP был проведен для проверки взаимодействия между PACT и PKR.Вкратце, лизаты супернатантов готовили путем инкубации 1×10 7 лизированных клеток в 1×буфере RIP с последующим центрифугированием при 13000 об/мин в течение 15 минут при 4°C.Лизаты загружали магнитными шариками с белком A+G, конъюгировали с 5 мкг антитела против PACT и осторожно вращали в течение ночи при 4°C.Гранулы промывали 3 раза буфером 5×RIP, дважды буфером 1×RIP и элюировали буфером 1×SDS.Восстановленный белок анализировали с помощью геля SDS-PAGE и обнаруживали с помощью WB.
Два пмоль помеченного PACT и 1 пмоль PKR очищали от E. coli.Развести в 1× буфере RIP и инкубировать с 10 пмоль ренатурированной РНК в течение 2 часов при 4 ° C.После этого их инкубировали с антимеченым антителом, конъюгированным с магнитными шариками белка A+G, в течение дополнительных двух часов.Затем шарики промывали четыре раза 1x RIP-буфером и элюировали 1x SDS-буфером.Полученные PACT и PKR были обнаружены WB.