Новости

Спасибо, что посетили Nature.com.Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Эффективные фотосенсибилизаторы особенно важны для широкого клинического применения фототерапии.Однако обычные фотосенсибилизаторы обычно страдают от коротковолнового поглощения, недостаточной фотостабильности, низкого квантового выхода активных форм кислорода (АФК) и индуцированного агрегацией тушения АФК.Здесь мы сообщаем о супрамолекулярном фотосенсибилизаторе (RuDA) ближнего инфракрасного диапазона (NIR), опосредованном самосборкой металлоорганических комплексов Ru (II)-арена в водном растворе.RuDA может генерировать синглетный кислород (1O2) только в агрегированном состоянии, и он демонстрирует очевидное поведение генерации 1O2, вызванное агрегацией, из-за значительного увеличения процесса кроссовера между синглетно-триплетной системой.Под действием лазерного излучения с длиной волны 808 нм RuDA демонстрирует квантовый выход 1O2 16,4% (одобренный FDA индоцианиновый зеленый: ΦΔ=0,2%) и высокую эффективность фототермического преобразования 24,2% (коммерческие золотые наностержни) с превосходной фотостабильностью.: 21,0%, золотые нанооболочки: 13,0%).Кроме того, НЧ РуДА с хорошей биосовместимостью могут предпочтительно накапливаться в местах опухоли, вызывая значительную регрессию опухоли при фотодинамической терапии с уменьшением объема опухоли на 95,2% in vivo.Эта фотодинамическая терапия, усиливающая агрегацию, обеспечивает стратегию разработки фотосенсибилизаторов с благоприятными фотофизическими и фотохимическими свойствами.
По сравнению с традиционной терапией фотодинамическая терапия (ФДТ) является привлекательным методом лечения рака благодаря своим значительным преимуществам, таким как точный пространственно-временной контроль, неинвазивность, незначительная лекарственная устойчивость и минимизация побочных эффектов 1,2,3.При световом облучении используемые фотосенсибилизаторы могут активироваться с образованием высокореактивных форм кислорода (АФК), что приводит к апоптозу/некрозу или иммунным ответам4,5. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахины, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к сильному проникновению света из-за поглощения поглощением биологических частиц (например, гемоглобина и меланина) в видимой области6,7. Однако наиболее распространенные фотосенсибилизаторы, такие как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно короткой длиной волны поглощения (< 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимой области6,7.然而 ， 传统 的 光敏剂 ， 如 二 氢 卟酚 、 卟啉 蒽醌 ， 具有 相对 短 的 的 波长 吸收 （频率 <680 нм) ， 由于 对 生物 分子 （血红 蛋白 和 黑色素） 的 吸收 ， 生物 （血红 和 黑色素 的 强烈 ， ， ， ，导致光穿透性差。然而 ， 传统 的 光敏剂 ， 二 氢 卟酚 、 卟啉 蒽醌 ， 相对 较 短 的 波长 吸收 （频率 频率 <680 нм) 因此 对 分子 （蛋白 和 黑色素） 的 ， ， ， 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 ， ， ， 吸收 吸收 吸收吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Однако редко встречающиеся фотосенсибилизаторы, такие как хлорины, порфирины и антрахины, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света.Видимая область 6.7.Следовательно, фотосенсибилизаторы, поглощающие ближний инфракрасный диапазон (БИК), которые активируются в «терапевтическом окне» 700–900 нм, хорошо подходят для фототерапии.Поскольку ближний инфракрасный свет меньше всего поглощается биологическими тканями, он может привести к более глубокому проникновению и меньшему фотоповреждению8,9.
К сожалению, существующие фотосенсибилизаторы, поглощающие NIR, обычно имеют плохую фотостабильность, низкую способность генерировать синглетный кислород (1O2) и индуцированное агрегацией тушение 1O2, что ограничивает их клиническое применение10,11.Хотя были предприняты большие усилия для улучшения фотофизических и фотохимических свойств обычных фотосенсибилизаторов, до сих пор в нескольких сообщениях сообщалось, что фотосенсибилизаторы, поглощающие NIR, могут решить все эти проблемы.Кроме того, некоторые фотосенсибилизаторы продемонстрировали перспективность эффективного образования 1O212,13,14 при облучении светом с длиной волны выше 800 нм, поскольку энергия фотонов быстро уменьшается в ближнем ИК-диапазоне.Трифениламин (TFA) в качестве донора электронов и [1,2,5]тиадиазол-[3,4-i]дипиридо[a,c]феназин (TDP) в качестве группы акцепторов электронов Красители донорно-акцепторного (DA) типа класс красителей, поглощающих ближний инфракрасный диапазон, которые были тщательно изучены для биовизуализации в ближнем инфракрасном диапазоне II и фототермической терапии (РТТ) из-за их узкой запрещенной зоны.Таким образом, красители DA-типа могут быть использованы для ФДТ с возбуждением в ближнем ИК-диапазоне, хотя они редко изучались в качестве фотосенсибилизаторов для ФДТ.
Хорошо известно, что высокая эффективность межсистемного кроссинга (ИСК) фотосенсибилизаторов способствует образованию 1О2.Общей стратегией продвижения процесса ISC является усиление спин-орбитальной связи (SOC) фотосенсибилизаторов путем введения тяжелых атомов или специальных органических фрагментов.Однако этот подход по-прежнему имеет некоторые недостатки и ограничения19,20.Недавно супрамолекулярная самосборка предоставила интеллектуальный подход «снизу вверх» для изготовления функциональных материалов на молекулярном уровне,21,22 с многочисленными преимуществами в фототерапии: (1) самособирающиеся фотосенсибилизаторы могут иметь потенциал для формирования ленточных структур.Подобно электронным структурам с более плотным распределением энергетических уровней из-за перекрывающихся орбит между строительными блоками.Следовательно, энергетическое соответствие между нижним синглетным возбужденным состоянием (S1) и соседним триплетным возбужденным состоянием (Tn) будет улучшено, что полезно для процесса ISC 23, 24 .(2) Супрамолекулярная сборка будет уменьшать безызлучательную релаксацию, основанную на механизме ограничения внутримолекулярного движения (RIM), который также способствует процессу ISC 25, 26 .(3) Супрамолекулярная сборка может защитить внутренние молекулы мономера от окисления и деградации, тем самым значительно улучшая фотостабильность фотосенсибилизатора.Учитывая вышеперечисленные преимущества, мы считаем, что системы супрамолекулярных фотосенсибилизаторов могут стать многообещающей альтернативой для преодоления недостатков ФДТ.
Комплексы на основе Ru(II) являются многообещающей медицинской платформой для потенциального применения в диагностике и терапии заболеваний благодаря их уникальным и привлекательным биологическим свойствам28,29,30,31,32,33,34.Кроме того, обилие возбужденных состояний и настраиваемые фотофизико-химические свойства комплексов на основе Ru(II) обеспечивают большие преимущества для разработки фотосенсибилизаторов на основе Ru(II)35,36,37,38,39,40.Ярким примером является полипиридиловый комплекс рутения (II) TLD-1433, который в настоящее время проходит фазу II клинических испытаний в качестве фотосенсибилизатора для лечения немышечно-инвазивного рака мочевого пузыря (NMIBC)41.Кроме того, металлоорганические комплексы арена рутения (II) широко используются в качестве химиотерапевтических средств для лечения рака из-за их низкой токсичности и простоты модификации42,43,44,45.Ионные свойства металлоорганических комплексов ру(II)-арена могут не только улучшать плохую растворимость хромофоров ДА в обычных растворителях, но и улучшать сборку хромофоров ДА.Кроме того, псевдооктаэдрическая полусэндвичевая структура металлоорганических комплексов Ru(II)-аренов может стерически препятствовать H-агрегации хромофоров DA-типа, способствуя тем самым образованию J-агрегации с полосами поглощения, смещенными в красную область.Однако присущие комплексам Ru(II)-арен недостатки, такие как низкая стабильность и/или плохая биодоступность, могут влиять на терапевтическую эффективность и активность комплексов арен-Ru(II) in vivo.Однако исследования показали, что эти недостатки можно преодолеть путем инкапсулирования комплексов рутения с биосовместимыми полимерами путем физического инкапсулирования или ковалентного сопряжения.
В этой работе мы сообщаем о DA-конъюгированных комплексах Ru(II)-арена (RuDA) с NIR-триггером через координационную связь между хромофором DAD и Ru(II)-ареновым фрагментом.Образующиеся комплексы могут самособираться в металлосупрамолекулярные везикулы в воде за счет нековалентных взаимодействий.Примечательно, что супрамолекулярная сборка наделяла RuDA индуцированными полимеризацией свойствами межсистемного кроссинговера, что значительно повышало эффективность ИСК, что было очень благоприятно для ФДТ (рис. 1А).Чтобы увеличить накопление опухоли и биосовместимость in vivo, одобренный FDA Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) был использован для инкапсулирования RuDA47,48,49 для создания наночастиц RuDA-NP (рис. 1B), которые действовали как высокоэффективный PDT/Dual-PDT. режим PTT-прокси.При фототерапии рака (рис. 1C) RuDA-NP использовали для лечения голых мышей с опухолями MDA-MB-231 для изучения эффективности PDT и PTT in vivo.
Схематическая иллюстрация фотофизического механизма RuDA в мономерной и агрегированной формах для фототерапии рака, синтез B RuDA-NPs и C RuDA-NPs для NIR-активированных PDT и PTT.
RuDA, состоящий из функциональных групп TPA и TDP, был приготовлен в соответствии с процедурой, показанной на дополнительном рисунке 1 (рис. 2A), а RuDA был охарактеризован спектрами ЯМР 1H и 13C, масс-спектрометрией с ионизацией электрораспылением и элементным анализом (дополнительные рисунки 2-4). ).Карта разности электронной плотности RuDA самого нижнего синглетного перехода была рассчитана с помощью теории функционала плотности, зависящей от времени (TD-DFT), для изучения процесса переноса заряда.Как показано на дополнительном рисунке 5, электронная плотность дрейфует в основном от трифениламина к акцепторной единице TDP после фотовозбуждения, что можно отнести к типичному внутримолекулярному переходу с переносом заряда (CT).
Химическая структура руды. Б Спектры поглощения руды в смесях различных соотношений ДМФА и воды.C Нормированные значения поглощения RuDA (800 нм) и ICG (779 нм) в зависимости от времени при 0,5 Вт см-2 лазерного излучения 808 нм.Г На фотодеградацию АБДА указывает индуцированное РуДА образование 1О2 в смесях ДМФА/Н2О с разным содержанием воды под действием лазерного излучения с длиной волны 808 нм и мощностью 0,5 Вт/см2.
Методом абсорбционной спектроскопии УФ-видимого диапазона изучены свойства самоорганизации руды в смесях ДМФА и воды в различных соотношениях.Как показано на рис.2В, RuDA демонстрирует полосы поглощения от 600 до 900 нм в ДМФА с максимальной полосой поглощения при 729 нм.Увеличение количества воды приводило к постепенному красному сдвигу максимума поглощения руды до 800 нм, что свидетельствует о J-агрегации руды в собранной системе.Спектры фотолюминесценции RuDA в различных растворителях показаны на дополнительном рисунке 6. RuDA, по-видимому, демонстрирует типичную люминесценцию NIR-II с максимальной длиной волны излучения ок.1050 нм в CH2Cl2 и CH3OH соответственно.Большой стоксов сдвиг (около 300 нм) РуДА указывает на значительное изменение геометрии возбужденного состояния и образование низкоэнергетических возбужденных состояний.Определены квантовые выходы люминесценции руды в CH2Cl2 и CH3OH, равные 3,3 и 0,6% соответственно.Однако в смеси метанола и воды (5/95, об./об.) наблюдалось небольшое красное смещение эмиссии и снижение квантового выхода (0,22%), что может быть связано с самосборкой руды. .
Для визуализации самосборки РУД использовали жидкостную атомно-силовую микроскопию (АСМ) для визуализации морфологических изменений РУД в растворе метанола после добавления воды.Когда содержание воды было ниже 80%, четкой агрегации не наблюдалось (дополнительная рис. 7).Однако при дальнейшем повышении содержания воды до 90–95 % появлялись мелкие наночастицы, что свидетельствовало о самосборке Руды. Кроме того, лазерное облучение с длиной волны 808 нм не влияло на интенсивность поглощения РуДА в водной среде. раствор (рис. 2C и дополнительная рис. 8).Напротив, поглощение индоцианинового зеленого (ICG в качестве контроля) быстро падало при 779 нм, что свидетельствует об отличной фотостабильности RuDA.Кроме того, стабильность RuDA-NPs в PBS (pH = 5,4, 7,4 и 9,0), 10% FBS и DMEM (с высоким содержанием глюкозы) исследовали с помощью спектроскопии поглощения в УФ-видимой области в различные моменты времени.Как показано на дополнительной фигуре 9, небольшие изменения в полосах поглощения RuDA-NP наблюдались в PBS при pH 7,4/9,0, FBS и DMEM, что указывает на превосходную стабильность RuDA-NP.Однако в кислой среде (рН = 5,4) обнаружен гидролиз руды.Мы также дополнительно оценили стабильность RuDA и RuDA-NP с использованием методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).Как показано на дополнительной фигуре 10, RuDA был стабилен в смеси метанола и воды (50/50, об./об.) в течение первого часа, а гидролиз наблюдался через 4 часа.Однако для НЧ RuDA наблюдался только широкий вогнуто-выпуклый пик.Поэтому для оценки стабильности НЧ RuDA в PBS (pH = 7,4) использовали гель-проникающую хроматографию (ГПХ).Как показано на дополнительной фигуре 11, после 8 часов инкубации в испытанных условиях высота пика, ширина пика и площадь пика NP RuDA существенно не изменились, что указывает на превосходную стабильность NP RuDA.Кроме того, изображения ПЭМ показали, что морфология наночастиц RuDA-NP практически не изменилась через 24 часа в разбавленном буфере PBS (pH = 7,4, дополнительная рис. 12).
Поскольку самосборка может придавать руде различные функциональные и химические характеристики, мы наблюдали высвобождение 9,10-антрацендиилбис(метилен)дималоновой кислоты (ABDA, индикатор 1O2) в смесях метанол-вода.Руда с различным содержанием воды50.Как показано на рисунке 2D и дополнительном рисунке 13, деградации ABDA не наблюдалось, когда содержание воды было ниже 20%.При повышении влажности до 40% происходила деградация АБДА, о чем свидетельствовало снижение интенсивности флуоресценции АБДА.Также было замечено, что более высокое содержание воды приводит к более быстрому разложению, что позволяет предположить, что самосборка RuDA необходима и полезна для разложения ABDA.Это явление сильно отличается от современных хромофоров ACQ (агрегационно-индуцированное тушение).При облучении лазером с длиной волны 808 нм квантовый выход 1O2 РуДА в смеси 98% H2O/2% ДМФ составляет 16,4%, что в 82 раза выше, чем у ИЦГ (ΦΔ = 0,2%)51, демонстрируя замечательную эффективность генерации 1О2 РуДА в агрегатном состоянии.
Электронные спины с использованием 2,2,6,6-тетраметил-4-пиперидинона (TEMP) и N-оксида 5,5-диметил-1-пирролина (DMPO) в качестве спиновых ловушек Для идентификации полученных частиц использовали резонансную спектроскопию (ESR). АФК.по РуДА.Как показано на дополнительной фигуре 14, было подтверждено, что 1O2 образуется при времени облучения от 0 до 4 минут.Кроме того, при инкубации РуДА с ДМПО под облучением был обнаружен типичный четырехстрочный сигнал ЭПР аддукта ДМПО-ОН· 1:2:2:1, что свидетельствует об образовании гидроксильных радикалов (ОН·).В целом, приведенные выше результаты демонстрируют способность RuDA стимулировать выработку АФК посредством процесса фотосенсибилизации двойного типа I/II.
Чтобы лучше понять электронные свойства РуДА в мономерной и агрегированной формах, методом DFT были рассчитаны граничные молекулярные орбитали РуДА в мономерной и димерной формах.Как показано на рис.3А, самая высокая занятая молекулярная орбиталь (ВЗМО) мономерного RuDA делокализована вдоль основной цепи лиганда, а самая нижняя незанятая молекулярная орбиталь (НСМО) сосредоточена на акцепторной единице TDP.Наоборот, в димерной ВЗМО электронная плотность сосредоточена на лиганде одной молекулы РуДА, а в НСМО в основном сосредоточена на акцепторном звене другой молекулы РуДА, что указывает на то, что РуДА находится в димере.Особенности КТ.
A ВЗМО и НСМО Оре рассчитываются в мономерной и димерной формах.B Синглетные и триплетные энергетические уровни руды в мономерах и димерах.C Расчетные уровни RuDA и возможные каналы ISC в виде мономерного C и димерного D. Стрелки указывают на возможные каналы ISC.
Распределение электронов и дырок в низкоэнергетических синглетных возбужденных состояниях РуДА в мономерной и димерной формах анализировали с помощью программы Multiwfn 3.852.53, которые рассчитывали методом TD-DFT.Как указано на дополнительной этикетке.Как показано на рисунках 1-2, мономерные дырки RDA в основном делокализованы вдоль основной цепи лиганда в этих синглетных возбужденных состояниях, в то время как электроны в основном расположены в группе TDP, демонстрируя внутримолекулярные характеристики CT.Кроме того, для этих синглетных возбужденных состояний существует более или менее перекрытие между дырками и электронами, что позволяет предположить, что эти синглетные возбужденные состояния вносят некоторый вклад от локального возбуждения (LE).Для димеров, помимо внутримолекулярных признаков CT и LE, определенная доля признаков межмолекулярного CT наблюдалась в соответствующих состояниях, особенно S3, S4, S7 и S8, на основе анализа межмолекулярного CT, с CT межмолекулярными переходами в качестве основных. (Дополнительная таблица).3).
Чтобы лучше понять экспериментальные результаты, мы дополнительно изучили свойства возбужденных состояний RuDA, чтобы изучить различия между мономерами и димерами (дополнительные таблицы 4–5).Как показано на рисунке 3B, энергетические уровни синглетных и триплетных возбужденных состояний димера намного плотнее, чем у мономера, что помогает уменьшить энергетический зазор между S1 и Tn. Сообщалось, что переходы ISC могут быть реализованы в пределах небольшой энергетической щели (ΔES1-Tn <0,3 эВ) между S1 и Tn54. Сообщалось, что переходы ISC могут быть реализованы в пределах небольшой энергетической щели (ΔES1-Tn <0,3 эВ) между S1 и Tn54. Сообщалось, что переходы ISC были реализованы в пределах небольшого континента щели (ΔES1-Tn <0,3 эВ) между S1 и Tn54. Сообщалось, что переходы ISC могут быть реализованы в пределах небольшой энергетической щели (ΔES1-Tn <0,3 эВ) между S1 и Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 эВ）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 эВ）内实现。 Сообщалось, что переход ISC может быть реализован в пределах небольших энергетических щелей (ΔES1-Tn < 0,3 эВ) между S1 и Tn54. Сообщалось, что переход ISC может быть реализован в пределах небольшой энергетической щели (ΔES1-Tn <0,3 эВ) между S1 и Tn54.Кроме того, только одна орбиталь, занятая или незанятая, должна различаться связанными синглетными и триплетными состояниями, чтобы обеспечить ненулевой интеграл SOC.Таким образом, на основе анализа энергии возбуждения и орбитального перехода на рис.3С, Д.Примечательно, что в мономере доступен только один канал ISC, тогда как димерная форма имеет четыре канала ISC, которые могут усиливать переход ISC.Поэтому разумно предположить, что чем больше молекул РуДА будет агрегировано, тем доступнее будут каналы ИСК.Следовательно, агрегаты RuDA могут образовывать двухзонные электронные структуры в синглетном и триплетном состояниях, уменьшая энергетический разрыв между S1 и доступным Tn, тем самым увеличивая эффективность ISC для облегчения генерации 1O2.
Чтобы дополнительно прояснить лежащий в основе механизм, мы синтезировали эталонное соединение комплекса арен-Ru (II) (RuET), заменив две этильные группы двумя фенильными группами трифениламина в RuDA (рис. 4A, для полной характеристики см. ESI, Supplementary 15). -21) От донора (диэтиламин) к акцептору (TDF) RuET имеет такие же внутримолекулярные характеристики CT, как и RuDA.Как и ожидалось, спектр поглощения РуЭТ в ДМФА показал низкоэнергетическую полосу переноса заряда с сильным поглощением в ближней инфракрасной области в области 600–1100 нм (рис. 4Б).Кроме того, агрегация RuET также наблюдалась с увеличением содержания воды, что отражалось в красном смещении максимума поглощения, что было дополнительно подтверждено жидкостной АСМ-визуализацией (дополнительная рис. 22).Результаты показывают, что RuET, как и RuDA, может образовывать внутримолекулярные состояния и самособираться в агрегированные структуры.
Химическая структура РуЭТ.Б Спектры поглощения РуЭТ в смесях различных соотношений ДМФА и воды.Сюжеты C EIS Найквиста для RuDA и RuET.Фототоковые отклики D РуДА и РуЭТ под действием лазерного излучения с длиной волны 808 нм.
Фотодеградацию АБДА в присутствии РуЭТ оценивали при облучении лазером с длиной волны 808 нм.Удивительно, но в различных фракциях воды не наблюдалось разложения ABDA (дополнительная рис. 23).Возможная причина заключается в том, что RuET не может эффективно формировать полосчатую электронную структуру, поскольку этильная цепь не способствует эффективному межмолекулярному переносу заряда.Поэтому для сравнения фотоэлектрохимических свойств RuDA и RuET были выполнены спектроскопия электрохимического импеданса (EIS) и измерения переходного фототока.Согласно графику Найквиста (рис. 4C), RuDA показывает гораздо меньший радиус, чем RuET, что означает, что RuDA56 имеет более быстрый межмолекулярный перенос электронов и лучшую проводимость.Кроме того, плотность фототока RuDA намного выше, чем у RuET (рис. 4D), что подтверждает лучшую эффективность переноса заряда RuDA57.Таким образом, фенильная группа трифениламина в руде играет важную роль в обеспечении межмолекулярного переноса заряда и формировании зонной электронной структуры.
Чтобы увеличить накопление опухоли и биосовместимость in vivo, мы дополнительно инкапсулировали RuDA с F127.Средний гидродинамический диаметр RuDA-NPs был определен как 123,1 нм с узким распределением (PDI = 0,089) с использованием метода динамического рассеяния света (DLS) (рис. 5A), который способствовал накоплению опухоли за счет увеличения проницаемости и удержания.ЭПР) эффект.Изображения ПЭМ показали, что НЧ руды имеют однородную сферическую форму со средним диаметром 86 нм.Примечательно, что максимум поглощения RuDA-NP появился при 800 нм (дополнительная рис. 24), что указывает на то, что RuDA-NP могут сохранять функции и свойства самособирающихся RuDA.Расчетный квантовый выход АФК для NP Ore составляет 15,9%, что сравнимо с Ore. Фототермические свойства NP RuDA изучались под действием лазерного излучения с длиной волны 808 нм с помощью инфракрасной камеры.Как показано на рис.5B,C, в контрольной группе (только PBS) наблюдалось небольшое повышение температуры, в то время как температура раствора RuDA-NPs быстро повышалась с повышением температуры (ΔT) до 15,5, 26,1 и 43,0°C.Высокие концентрации составляли 25, 50 и 100 мкМ соответственно, что свидетельствует о сильном фототермическом эффекте НЧ RuDA.Кроме того, были проведены измерения цикла нагрева/охлаждения для оценки фототермической стабильности RuDA-NP и сравнения с ICG.Температура НЧ руды не снизилась после пяти циклов нагрева/охлаждения (рис. 5D), что указывает на превосходную фототермическую стабильность НЧ руды.Напротив, ICG проявляет более низкую фототермическую стабильность, о чем свидетельствует явное исчезновение плато фототермической температуры в тех же условиях.Согласно предыдущему методу58, эффективность фототермического преобразования (PCE) RuDA-NP была рассчитана как 24,2%, что выше, чем у существующих фототермических материалов, таких как золотые наностержни (21,0%) и золотые нанооболочки (13,0%)59.Таким образом, NP Ore обладают отличными фототермическими свойствами, что делает их перспективными агентами ПТТ.
Анализ изображений DLS и TEM НЧ RuDA (вставка).B Тепловые изображения различных концентраций НЧ RuDA, подвергнутых воздействию лазерного излучения с длиной волны 808 нм (0,5 Вт см-2).C Кривые фототермической конверсии различных концентраций НЧ руды, которые являются количественными данными.B. D Повышение температуры ORE NP и ICG в течение 5 циклов нагрева-охлаждения.
Фотоцитотоксичность НЧ RuDA в отношении клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231 оценивали in vitro.Как показано на рис.6A, B, RuDA-NPs и RuDA проявляли незначительную цитотоксичность в отсутствие облучения, что указывает на более низкую темновую токсичность RuDA-NPs и RuDA.Однако после воздействия лазерным излучением с длиной волны 808 нм НЧ РуДА и РуДА проявляли сильную фотоцитотоксичность в отношении раковых клеток MDA-MB-231 со значениями IC50 (полумаксимальной ингибирующей концентрации) 5,4 и 9,4 мкМ соответственно, демонстрируя что RuDA-NP и RuDA обладают потенциалом для фототерапии рака.Кроме того, фотоцитотоксичность RuDA-NP и RuDA дополнительно исследовали в присутствии витамина С (Vc), поглотителя АФК, для выяснения роли АФК в индуцированной светом цитотоксичности.Очевидно, что после добавления Vc жизнеспособность клеток повышалась, а значения IC50 НЧ РуДА и РуДА составляли 25,7 и 40,0 мкМ соответственно, что доказывает важную роль АФК в фотоцитотоксичности НЧ РуДА и РуДА.Светоиндуцированная цитотоксичность RuDA-NPs и RuDA в раковых клетках MDA-MB-231 путем окрашивания живых/мертвых клеток с использованием кальцеина AM (зеленая флуоресценция для живых клеток) и йодида пропидия (PI, красная флуоресценция для мертвых клеток).подтверждается клетками) в качестве флуоресцентных зондов.Как показано на рисунке 6C, клетки, обработанные RuDA-NP или RuDA, оставались жизнеспособными без облучения, о чем свидетельствует интенсивная зеленая флуоресценция.Напротив, при лазерном облучении наблюдалась только красная флуоресценция, что подтверждает эффективную фотоцитотоксичность РуДА или НЧ РуДА.Примечательно, что при добавлении Vc появлялась зеленая флуоресценция, что свидетельствует о нарушении фотоцитотоксичности RuDA и НЧ RuDA.Эти результаты согласуются с анализами фотоцитотоксичности in vitro.
Дозозависимая жизнеспособность клеток A RuDA- и B RuDA-NP в клетках MDA-MB-231 в присутствии или в отсутствие Vc (0,5 мМ) соответственно.Столбики погрешностей, среднее значение ± стандартное отклонение (n = 3). Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001.C Анализ окрашивания живых/мертвых клеток с использованием кальцеина АМ и йодида пропидия в качестве флуоресцентных зондов.Масштабная линейка: 30 мкм.Показаны репрезентативные изображения трех биологических повторов из каждой группы.D Конфокальные флуоресцентные изображения продукции АФК в клетках MDA-MB-231 при различных условиях обработки.Зеленая флуоресценция DCF указывает на присутствие АФК.Облучать лазером с длиной волны 808 нм мощностью 0,5 Вт/см2 в течение 10 минут (300 Дж/см2).Масштабная линейка: 30 мкм.Показаны репрезентативные изображения трех биологических повторов из каждой группы.E Проточная цитометрия Анализ лечения RuDA-NPs (50 мкМ) или RuDA (50 мкМ) с лазером 808 нм (0,5 Вт см-2) или без него в присутствии и в отсутствие Vc (0,5 мМ) в течение 10 мин.Показаны репрезентативные изображения трех биологических повторов из каждой группы.F Nrf-2, HSP70 и HO-1 клеток MDA-MB-231, обработанных RuDA-NPs (50 мкМ) с лазерным облучением 808 нм или без него (0,5 Вт см-2, 10 мин, 300 Дж см-2), клетки экспрессируют 2).Показаны репрезентативные изображения двух биологических повторов из каждой группы.
Внутриклеточную продукцию АФК в клетках MDA-MB-231 исследовали с использованием метода окрашивания 2,7-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетатом (DCFH-DA).Как показано на рис.6D, клетки, обработанные RuDA-NP или RuDA, проявляли отчетливую зеленую флуоресценцию при облучении лазером с длиной волны 808 нм, что указывает на то, что RuDA-NP и RuDA обладают эффективной способностью генерировать АФК.Наоборот, в отсутствие света или в присутствии Вк наблюдался лишь слабый флуоресцентный сигнал клеток, что указывало на незначительное образование АФК.Уровни внутриклеточных АФК в клетках RuDA-NP и клетках MDA-MB-231, обработанных RuDA, дополнительно определяли с помощью проточной цитометрии.Как показано на дополнительной фигуре 25, средняя интенсивность флуоресценции (MFI), генерируемая RuDA-NPs и RuDA при лазерном облучении 808 нм, была значительно увеличена примерно в 5,1 и 4,8 раза соответственно по сравнению с контрольной группой, подтверждая их отличное образование AFK.вместимость.Однако внутриклеточные уровни АФК в клетках RuDA-NP или MDA-MB-231, обработанных RuDA, были сопоставимы только с контролем без лазерного облучения или в присутствии Vc, как и результаты конфокального флуоресцентного анализа.
Показано, что митохондрии являются основной мишенью ру(II)-ареновых комплексов60.Поэтому была исследована субклеточная локализация RuDA и RuDA-NPs.Как показано на дополнительной фигуре 26, RuDA и RuDA-NP демонстрируют схожие профили клеточного распределения с самым высоким накоплением в митохондриях (62,5 ± 4,3 и 60,4 ± 3,6 нг/мг белка соответственно).Однако в ядерных фракциях руды и NP-руды было обнаружено лишь небольшое количество Ru (3,5 и 2,1% соответственно).Оставшаяся клеточная фракция содержала остаточный рутений: 31,7% (30,6 ± 3,4 нг/мг белка) для RuDA и 42,9% (47,2 ± 4,5 нг/мг белка) для RuDA-NPs.В целом руда и NP руда в основном накапливаются в митохондриях.Для оценки митохондриальной дисфункции мы использовали окрашивание JC-1 и MitoSOX Red для оценки потенциала митохондриальной мембраны и способности вырабатывать супероксид соответственно.Как показано на дополнительном рисунке 27, в клетках, обработанных как RuDA, так и RuDA-NPs, при лазерном облучении с длиной волны 808 нм наблюдалась интенсивная зеленая (JC-1) и красная (MitoSOX Red) флуоресценция, что указывает на то, что и RuDA, и RuDA-NP сильно флуоресцируют. Он может эффективно индуцировать деполяризацию митохондриальной мембраны и продукцию супероксида.Кроме того, механизм гибели клеток определяли с помощью проточной цитометрии на основе анализа аннексина V-FITC/йодида пропидия (PI).Как показано на рисунке 6E, при облучении лазером с длиной волны 808 нм RuDA и RuDA-NP индуцировали значительно повышенную скорость раннего апоптоза (нижний правый квадрант) в клетках MDA-MB-231 по сравнению с PBS или PBS плюс лазер.обработанные клетки.Однако при добавлении Vc скорость апоптоза RuDA и RuDA-NP значительно снижалась с 50,9% и 52,0% до 15,8% и 17,8% соответственно, что подтверждает важную роль АФК в фотоцитотоксичности RuDA и RuDA-NP..Кроме того, во всех протестированных группах наблюдались небольшие некротические клетки (верхний левый квадрант), что свидетельствует о том, что апоптоз может быть преобладающей формой гибели клеток, индуцированной RuDA и RuDA-NPs.
Поскольку повреждение окислительного стресса является основной детерминантой апоптоза, ядерный фактор, связанный с эритроидным фактором 2, фактором 2 (Nrf2) 62, ключевым регулятором антиоксидантной системы, был исследован в MDA-MB-231, обработанном RuDA-NPs.Механизм действия НЧ РУДА, индуцированных облучением.В то же время также была обнаружена экспрессия нижестоящей белковой гемоксигеназы 1 (HO-1).Как показано на рисунке 6F и дополнительном рисунке 29, фототерапия, опосредованная RuDA-NP, повышала уровни экспрессии Nrf2 и HO-1 по сравнению с группой, получавшей PBS, что указывает на то, что RuDA-NP могут стимулировать сигнальные пути окислительного стресса.Кроме того, для изучения фототермического эффекта RuDA-NPs63 также оценивали экспрессию белка теплового шока Hsp70.Понятно, что клетки, обработанные RuDA-NPs + лазерное облучение с длиной волны 808 нм, демонстрировали повышенную экспрессию Hsp70 по сравнению с двумя другими группами, что отражает клеточный ответ на гипертермию.
Замечательные результаты in vitro побудили нас исследовать эффективность RuDA-NP in vivo у голых мышей с опухолями MDA-MB-231.Тканевое распределение НЧ РуДА изучали путем определения содержания рутения в печени, сердце, селезенке, почках, легких и опухолях.Как показано на рис.7А максимальное содержание НЧ руды в нормальных органах появлялось в первый срок наблюдения (4 ч), а максимальное содержание определялось в опухолевых тканях через 8 ч после инъекции, возможно, за счет НЧ руды.ЭПР-эффект LF.По результатам распределения оптимальная продолжительность обработки рудой NP была принята через 8 часов после введения.Чтобы проиллюстрировать процесс накопления НЧ РуДА в опухолевых участках, фотоакустические (ФА) свойства НЧ РуДА контролировали путем регистрации ПА-сигналов НЧ РуДА в разное время после инъекции.Во-первых, PA-сигнал RuDA-NP in vivo оценивали путем записи PA-изображений участка опухоли после внутриопухолевого введения RuDA-NP.Как показано на дополнительной фигуре 30, RuDA-NP продемонстрировали сильный сигнал PA, и была положительная корреляция между концентрацией RuDA-NP и интенсивностью сигнала PA (дополнительная фигура 30A).Затем регистрировали ПА in vivo изображения опухолевых участков после внутривенного введения РуДА и РуДА-НП в разные моменты времени после введения.Как показано на фигуре 7B, сигнал PA RuDA-NPs от участка опухоли постепенно увеличивался со временем и достигал плато через 8 часов после инъекции, что согласуется с результатами распределения в тканях, определенными анализом ICP-MS.Что касается RuDA (дополнительная рис. 30B), максимальная интенсивность сигнала PA появлялась через 4 часа после инъекции, что указывает на быструю скорость проникновения RuDA в опухоль.Кроме того, экскреторное поведение RuDA и RuDA-NPs исследовали путем определения количества рутения в моче и фекалиях с помощью ICP-MS.Основной путь выведения RuDA (дополнительная рис. 31) и НП РУДА (рис. 7C) — через фекалии, и эффективный клиренс РУДА и НП РУДА наблюдался в течение 8-дневного периода исследования, что означает, что РУДА и НЧ руДА могут эффективно выводиться из организма без долговременной токсичности.
А. Распределение RuDA-NP ex vivo в тканях мыши определяли по содержанию Ru (процент вводимой дозы Ru (ID) на грамм ткани) в разные моменты времени после инъекции.Данные средние ± стандартное отклонение (n = 3). Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001.B PA-изображения опухолевых участков in vivo при возбуждении 808 нм после внутривенного введения RuDA-NPs (10 мкмоль кг-1) в разные моменты времени.После внутривенного введения НЧ РуДА (10 мкмоль кг-1) С Ру выводился из мышей с мочой и фекалиями в разные промежутки времени.Данные средние ± стандартное отклонение (n = 3).
Нагревательную способность RuDA-NP in vivo изучали на голых мышах с опухолями MDA-MB-231 и RuDA для сравнения.Как показано на рис.8A и дополнительной фиг. 32, контрольная (физиологический раствор) группа показала меньшее изменение температуры (ΔT ≈ 3 °C) после 10 минут непрерывного воздействия.Однако температура RuDA-NPs и RuDA быстро увеличивалась с максимальными температурами 55,2 и 49,9 ° C соответственно, обеспечивая достаточную гипертермию для терапии рака in vivo.Наблюдаемое повышение высокой температуры для НЧ РуДА (ΔT ≈ 24°C) по сравнению с RuDA (ΔT ≈ 19°C) может быть связано с его лучшей проницаемостью и накоплением в опухолевых тканях за счет эффекта ЭПР.
Инфракрасные тепловые изображения мышей с опухолями MDA-MB-231, облученных лазером с длиной волны 808 нм в разное время через 8 часов после инъекции.Показаны репрезентативные изображения четырех биологических повторов из каждой группы.B Относительный объем опухоли и C Средняя масса опухоли различных групп мышей во время лечения.D Кривые массы тела разных групп мышей.Облучать лазером с длиной волны 808 нм мощностью 0,5 Вт/см2 в течение 10 минут (300 Дж/см2).Столбики погрешностей, среднее значение ± стандартное отклонение (n = 3). Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-тесты *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p<0,05, **p<0,01 и ***p<0,001. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологических проявлений, физиологических проявлений + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая группы солевого раствора, солевого раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser.来自 不同 组 的 主要 器官 和 肿瘤 的 e h & e 染色 图像 ， 包括 、 盐 水 水 + 激光 、 ruda 、 ruda + 激光 、 ruda-nps 和 ruda-nps + 激光组。。 激光组 激光组 激光组来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E органов основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая поиск растворов, применение растворов + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. Окрашивание E H&E основных органов и опухолей в различных группах лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер.Масштабная линейка: 60 ​​мкм.
Эффект фототерапии in vivo с использованием RuDA и НЧ RuDA оценивали, у голых мышей с опухолями MDA-MB-231 внутривенно вводили НЧ RuDA или RuDA в разовой дозе 10,0 мкмоль кг-1 через хвостовую вену, а затем 8 часов после инъекции.лазерное облучение с длиной волны 808 нм.Как показано на Фигуре 8B, объемы опухоли были значительно увеличены в группах, получавших физиологический раствор и лазер, что указывает на то, что облучение физиологическим раствором или лазером 808 мало влияло на рост опухоли.Как и в группе, получавшей физиологический раствор, быстрый рост опухоли также наблюдался у мышей, получавших RuDA-NPs или RuDA в отсутствие лазерного облучения, что свидетельствует об их низкой темновой токсичности.Напротив, после лазерного облучения как RuDA-NP, так и RuDA-терапия индуцировали значительную регрессию опухоли с уменьшением объема опухоли на 95,2% и 84,3% соответственно по сравнению с группой, получавшей солевой раствор, что указывает на отличный синергетический эффект ФДТ., опосредованный эффектом РуДА/ЧТВ.– НЧ или руда. По сравнению с РуДА НЧ РуДА проявляли лучший фототерапевтический эффект, что в основном было связано с ЭПР-эффектом НЧ РуДА.Результаты ингибирования роста опухоли дополнительно оценивали по массе опухоли, иссеченной на 15-й день лечения (фиг. 8C и дополнительная фиг. 33).Средняя масса опухоли у мышей, получавших RuDA-NP, и мышей, получавших RuDA, составляла 0,08 и 0,27 г соответственно, что было намного легче, чем в контрольной группе (1,43 г).
Кроме того, массу тела мышей регистрировали каждые три дня для изучения темновой токсичности НЧ РуДА или РуДА in vivo.Как показано на Фигуре 8D, существенных различий в массе тела не наблюдалось для всех групп лечения. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) из разных групп лечения. Кроме того, выполняли окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) из разных групп лечения. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) из разных групп лечения. Кроме того, выполняли окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) из разных групп лечения.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行苏木精和伊红(H&E) 染色。 (ОН) Кроме того, проводится окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) в различных группах лечения. Кроме того, в различных лечебных группах проводили окрашивание основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) гематоксилином и эозином (H&E).Как показано на рис.8E, окрашенные гематоксилин-эозином изображения пяти основных органов из групп RuDA-NPs и RuDA не демонстрируют явных аномалий или повреждений органов. 8E, окрашенные гематоксилин-эозином изображения пяти основных органов из групп RuDA-NPs и RuDA не демонстрируют явных аномалий или повреждений органов.Как показано на рис.8E, окрашивание H&E пяти основных органов из группы RuDA-NPs и RuDA не обнаруживает явных аномалий или повреждений органов. 8E, окрашенные H&E изображения пяти основных органов из групп RuDA-NPs и RuDA не показывают явных аномалий или поражений органов.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显示出明显的异常或器官怍」如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Как показано на рисунке 8E, изображение окрашивания H&E пяти основных органов из группы RuDA-NPs и RuDA не выявило явных аномалий или повреждений органов. Как показано на рисунке 8E, изображения окрашивания H&E пяти основных органов из групп RuDA-NPs и RuDA не показали явных аномалий или повреждения органов.Эти результаты показали, что ни RuDA-NP, ни RuDA не проявляли признаков токсичности in vivo. Кроме того, изображения опухолей, окрашенные гематоксилин-эозином, показали, что обе группы RuDA + Laser и RuDA-NPs + Laser могут вызывать серьезное разрушение раковых клеток, демонстрируя превосходную фототерапевтическую эффективность RuDA и RuDA-NPs in vivo. Кроме того, изображения опухолей, окрашенные гематоксилин-эозином, показали, что обе группы RuDA + Laser и RuDA-NPs + Laser могут вызывать серьезное разрушение раковых клеток, демонстрируя превосходную фототерапевтическую эффективность RuDA и RuDA-NPs in vivo.Кроме того, окрашенные гематоксилин-эозином изображения опухолей показали, что обе группы RuDA+Laser и RuDA-NPs+Laser могут вызывать серьезное разрушение раковых клеток, демонстрируя превосходную фототерапевтическую эффективность RuDA и RuDA-NPs in vivo.此外 ， 的 的 h & e 染色 图像 显示 ， ， ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 导致 严重 的 癌细胞 破坏 ， 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 的 体内 光疗 功效。。。。。。。。 功效 功效 功效 功效此外 ， 的 的 & e 染色 显示 ， ， ruda + laser 和 ruda-nps + laser 组均 导致 癌 细胞 破坏 ， 证明 了 ruda 和 ruda-nps 的 体内 光疗 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。Кроме того, окрашенные гематоксилином и эозином изображения опухолей показали, что обе группы RuDA+Laser и RuDA-NPs+Laser приводили к тяжелой деструкции раковых клеток, демонстрируя превосходную фототерапевтическую эффективность RuDA и RuDA-NP in vivo.
В заключение, металлоорганический комплекс Ru(II)-арен (RuDA) с лигандами типа DA был разработан для облегчения процесса ISC с использованием метода агрегации.Синтезированный RuDA может самособираться за счет нековалентных взаимодействий с образованием супрамолекулярных систем, происходящих из RuDA, тем самым способствуя образованию 1O2 и эффективному фототермическому преобразованию для светоиндуцированной терапии рака.Примечательно, что мономерная РуДА не генерировала 1О2 при лазерном облучении на длине волны 808 нм, но могла генерировать большое количество 1О2 в агрегированном состоянии, демонстрируя рациональность и эффективность нашей конструкции.Последующие исследования показали, что супрамолекулярная сборка наделяет RuDA улучшенными фотофизическими и фотохимическими свойствами, такими как поглощение красного смещения и устойчивость к фотообесцвечиванию, которые весьма желательны для обработки PDT и PTT.В экспериментах как in vitro, так и in vivo показано, что НЧ РуДА с хорошей биосовместимостью и хорошим накоплением в опухоли проявляют прекрасную светоиндуцированную противораковую активность при лазерном облучении на длине волны 808 нм.Таким образом, НЧ РуДА как эффективные бимодальные супрамолекулярные реагенты ФДТ/ФТВ обогатят набор фотосенсибилизаторов, активирующихся на длинах волн выше 800 нм.Концептуальный дизайн супрамолекулярной системы обеспечивает эффективный путь для фотосенсибилизаторов, активируемых в ближней инфракрасной области спектра, с превосходными фотосенсибилизирующими эффектами.
Все химические вещества и растворители были получены от коммерческих поставщиков и использовались без дополнительной очистки.RuCl3 был приобретен у Boren Precious Metals Co., Ltd. (Куньмин, Китай).[(η6-p-cym)Ru(фендио)Cl]Cl (фендио = 1,10-фенантролин-5,6-дион) и 4,7-бис[4-(N,N-дифениламино)фенил]-5 ,6-Диамино-2,1,3-бензотиадиазол был синтезирован в соответствии с предыдущими исследованиями64,65.Спектры ЯМР записывали на спектрометре Bruker Avance III-HD 600 МГц в Аналитическом испытательном центре Юго-Восточного университета с использованием d6-ДМСО или CDCl3 в качестве растворителя.Химические сдвиги δ даны в м.д.по отношению к тетраметилсилану, а константы взаимодействия J даны в абсолютных значениях в герцах.Масс-спектрометрию высокого разрешения (HRMS) проводили на приборе Agilent 6224 ESI/TOF MS.Элементный анализ C, H и N выполнен на элементном анализаторе Vario MICROCHNOS (Elementar).УФ-видимые спектры измеряли на спектрофотометре Shimadzu UV3600.Спектры флуоресценции записывали на спектрофлуориметре Shimadzu RF-6000.Спектры ЭПР записывали на приборе Bruker EMXmicro-6/1.Морфологию и структуру приготовленных образцов исследовали на приборах FEI Tecnai G20 (TEM) и Bruker Icon (AFM), работающих при напряжении 200 кВ.Динамическое светорассеяние (ДРС) проводили на анализаторе Nanobrook Omni (Brookhaven).Фотоэлектрохимические свойства измеряли на электрохимической установке (CHI-660, Китай).Фотоакустические изображения были получены с помощью системы FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR.Конфокальные изображения получали с помощью конфокального микроскопа Olympus FV3000.Анализ FACS выполняли на проточном цитометре BD Calibur.Эксперименты по высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) проводили на системе Waters Alliance e2695 с использованием детектора 2489 UV/Vis.Тесты гель-проникающей хроматографии (ГПХ) регистрировали на приборе Thermo ULTIMATE 3000 с использованием детектора показателя преломления ERC RefratoMax520.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-фенантролин-5,6-дион)64 (481,0 мг, 1,0 ммоль), 4,7-бис[4-(N, N-дифениламино)фенил]-5,6-диамино-2,1,3-бензотиадиазол 65 (652,0 мг, 1,0 ммоль) и ледяную уксусную кислоту (30 мл) перемешивали в холодильнике с обратным холодильником в течение 12 часов.Затем растворитель удаляли в вакууме с использованием роторного испарителя.Полученный остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (силикагель, CH2Cl2:MeOH=20:1) с получением RuDA в виде зеленого порошка (выход: 877,5 мг, 80%).анус.Рассчитано для C64H48Cl2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Найдено: С 67,92, Н 4,26, N 9,82.1H ЯМР (600 МГц, d6-ДМСО) δ 10,04 (с, 2H), 8,98 (с, 2H), 8,15 (с, 2H), 7,79 (с, 4H), 7,44 (с, 8H), 7,21 (д, J = 31,2 Гц, 16H), 6,47 (с, 2H), 6,24 (с, 2H), 2,69 (с, 1H), 2,25 (с, 3H), 0,99 (с, 6H).13c nmr (150 MHZ, D6-DMSO), δ (PPM) 158.03, 152.81, 149.31, 147.98, 147.16, 139.98, 136.21, 135.57, 134.68, 130.34, 130.02, 128.68, 128.01, 125.51, 124.45, 120.81, 103.49, 103.49 , 103. , 86.52, 84.75, 63.29, 30.90, 22.29, 18.83.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 1097,25.
Синтез 4,7-бис[4-(N,N-диэтиламино)фенил-5,6-диамино-2,1,3-бензотиадиазола (L2): L2 синтезировали в две стадии.К 1,05 г (2,4 ммоль) N,N-диэтил-4-(трибутилстаннил)анилина и раствору 4,7-дибром-5,6-динитро-2 добавляли Pd(PPh3)4 (46 мг, 0,040 ммоль), 1,3-бензотиадиазол (0,38 г, 1,0 ммоль) в сухом толуоле (100 мл).Смесь перемешивали при 100°С в течение 24 часов.После удаления толуола в вакууме полученное твердое вещество промывали петролейным эфиром.Затем смесь этого соединения (234,0 мг, 0,45 ммоль) и порошка железа (0,30 г, 5,4 ммоль) в уксусной кислоте (20 мл) перемешивали при 80°С в течение 4 часов.Реакционную смесь выливали в воду и полученное коричневое твердое вещество собирали фильтрованием.Продукт дважды очищали сублимацией в вакууме с получением твердого вещества зеленого цвета (126,2 мг, выход 57%).анус.Рассчитано для C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Найдено: С 67,84, Н 6,95, Н 18,16.1H ЯМР (600 МГц, CDCl3), δ (м.д.) 7,42 (д, 4H), 6,84 (д, 4H), 4,09 (с, 4H), 3,42 (д, 8H), 1,22 (с, 12H).ЯМР 13С (150 МГц, CDCl3), δ (м.д.) 151.77, 147.39, 138.07, 131.20, 121.09, 113.84, 111.90, 44.34, 12.77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Соединения получали и очищали, следуя процедурам, аналогичным RuDA.анус.Рассчитано для C48H48Cl2N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Найдено: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81, 1H ЯМР (600 МГц, d6-ДМСО), δ (м.д.) 10,19 (с, 2H), 9,28 (с, 2H), 8,09 (с, 2H), 7,95 (с, 4Н), 6,93 (с, 4Н), 6,48 (д, 2Н), 6,34 (с, 2Н), 3,54 (т, 8Н), 2,80 (м, 1Н), 2,33 (с, 3Н), 1,31 (т, 12Н), 1,07 (с, 6Н).13C ЯМР (151 МГц, CDCL3), Δ (ppm) 158,20, 153,36, 148,82, 148,14, 138,59, 136,79, 135,75, 134,71, 130,44, 128,87, 128,35, 121,70, 111,84, 110,76, 105,07, 1044444444444444444444444444444, 104444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444., 38.06, 31.22, 29.69, 22.29, 19.19, 14.98, 12.93.ESI-MS: m/z [M-Cl]+ = 905,24.
RuDA растворяли в MeOH/H2O (5/95, об./об.) при концентрации 10 мкМ.Спектр поглощения РуДА измеряли каждые 5 минут на спектрофотометре Shimadzu UV-3600 при облучении лазерным светом с длиной волны 808 нм (0,5 Вт/см2).Спектры ICG записывали в тех же условиях, что и стандарт.
Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре Bruker EMXmicro-6/1 с мощностью СВЧ 20 мВт, диапазоном сканирования 100 Гс и модуляцией поля 1 Гс. 2,2,6,6-тетраметил-4-пиперидон (TEMP) и N-оксид 5,5-диметил-1-пирролина (DMPO) использовали в качестве спиновых ловушек.Спектры электронного спинового резонанса регистрировали для смешанных растворов РуДА (50 мкМ) и ТЭМФ (20 мМ) или ДМПО (20 мМ) под действием лазерного излучения с длиной волны 808 нм (0,5 Вт/см2).
Расчеты DFT и TD-DFT для RuDA проводились на уровнях PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ в водном растворе с использованием программы Gaussian 1666,67,68.Распределения ВЗМО-НСМО, дырок и электронов низкоэнергетического синглетного возбужденного состояния RuDA строили с помощью программы GaussView (версия 5.0).
Сначала мы попытались измерить эффективность генерации 1O2 RuDA, используя обычную УФ-видимую спектроскопию с ICG (ΦΔ = 0,002) в качестве стандарта, но фотодеградация ICG сильно повлияла на результаты.Так, квантовый выход 1О2 РуДА измеряли по изменению интенсивности флуоресценции АБДА около 428 нм при облучении лазером с длиной волны 808 нм (0,5 Вт/см2).Эксперименты проводили на RuDA и НЧ RuDA (20 мкМ) в воде/ДМФ (98/2, об./об.), содержащем АБДА (50 мкМ).Квантовый выход 1O2 рассчитывали по следующей формуле: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS и rICG – скорости реакции ABDA с 1O2, полученным из фотосенсибилизатора и ICG соответственно.APS и AICG представляют собой оптическую плотность фотосенсибилизатора и ICG при 808 нм соответственно.
АСМ-измерения проводились в жидкостных условиях с использованием режима сканирования на АСМ-системе Bruker Dimension Icon.Используя открытую структуру с жидкими ячейками, клетки дважды промывали этанолом и сушили током азота.Вставьте высушенные клетки в оптическую головку микроскопа.Немедленно поместите каплю образца в бассейн с жидкостью и поместите его на кантилевер с помощью стерильного одноразового пластикового шприца и стерильной иглы.Другая капля помещается непосредственно на образец, и когда оптическая головка опускается, две капли сливаются, образуя мениск между образцом и резервуаром с жидкостью.АСМ-измерения проводились с использованием V-образного нитридного кантилевера SCANASYST-FLUID (Bruker, твердость k = 0,7 Н·м-1, f0 = 120–180 кГц).
Хроматограммы ВЭЖХ получали на системе Waters e2695, оснащенной колонкой phoenix C18 (250×4,6 мм, 5 мкм) с использованием детектора 2489 UV/Vis.Длина волны детектора 650 нм.Подвижные фазы А и В представляли собой воду и метанол соответственно, а скорость потока подвижной фазы составляла 1,0 мл·мин-1.Градиент (растворитель B) был следующим: 100% от 0 до 4 минут, 100% до 50% от 5 до 30 минут и сброс до 100% от 31 до 40 минут.Руду растворяли в смешанном растворе метанола и воды (50/50 по объему) при концентрации 50 мкМ.Объем инъекции составлял 20 мкл.
Анализы ГПХ регистрировали на приборе Thermo ULTIMATE 3000, оснащенном двумя колонками PL aquagel-OH MIXED-H (2×300×7,5 мм, 8 мкм) и детектором показателя преломления ERC RefratoMax520.Колонку ГПХ элюировали водой со скоростью потока 1 мл/мин при 30°С.НЧ руды растворяли в растворе PBS (pH = 7,4, 50 мкМ), объем закачки 20 мкл.
Фототоки измеряли на электрохимической установке (CHI-660B, Китай).Оптоэлектронные отклики при включении и выключении лазера (808 нм, 0,5 Вт/см2) измерялись при напряжении 0,5 В в черном ящике соответственно.Использовалась стандартная трехэлектродная ячейка с L-образным стеклоуглеродным электродом (СУЭ) в качестве рабочего электрода, стандартным каломельным электродом (СКЭ) в качестве электрода сравнения и платиновым диском в качестве противоэлектрода.В качестве электролита использовали 0,1 М раствор Na2SO4.
Линия клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231 была приобретена у KeyGEN Biotec Co., LTD (Нанкин, Китай, каталожный номер: KG033).Клетки выращивали в монослоях в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, с высоким содержанием глюкозы) с добавлением раствора 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), пенициллина (100 мкг/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл).Все клетки культивировали при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2.
Анализ МТТ использовали для определения цитотоксичности RuDA и RuDA-NPs в присутствии и в отсутствие светового облучения, с Vc (0,5 мМ) или без него.Раковые клетки MDA-MB-231 выращивали в 96-луночных планшетах при плотности клеток примерно 1 x 105 клеток/мл/лунку и инкубировали в течение 12 часов при 37,0°C в атмосфере 5% CO2 и 95% воздуха.К клеткам добавляли растворенные в воде НЧ РуДА и РуДА.После 12 часов инкубации клетки подвергали воздействию лазерного излучения мощностью 0,5 Вт/см2 с длиной волны 808 нм в течение 10 минут (300 Дж/см2) и затем инкубировали в темноте в течение 24 часов.Затем клетки инкубировали с МТТ (5 мг/мл) еще в течение 5 часов.Наконец, измените среду на ДМСО (200 мкл), чтобы растворить полученные фиолетовые кристаллы формазана.Значения ОП измеряли с помощью ридера микропланшетов с длиной волны 570/630 нм.Значение IC50 для каждого образца рассчитывали с использованием программного обеспечения SPSS из кривых доза-реакция, полученных по меньшей мере из трех независимых экспериментов.
Клетки MDA-MB-231 обрабатывали RuDA и RuDA-NP в концентрации 50 мкМ.Через 12 ч инкубации клетки облучали лазером с длиной волны 808 нм и мощностью 0,5 Вт/см2 в течение 10 мин (300 Дж/см2).В группе с витамином С (Vc) клетки обрабатывали 0,5 мМ Vc перед лазерным облучением.Затем клетки инкубировали в темноте в течение дополнительных 24 часов, затем окрашивали кальцеином АМ и йодидом пропидия (20 мкг/мл, 5 мкл) в течение 30 минут, затем промывали PBS (10 мкл, рН 7,4).изображения окрашенных клеток.