Новости

Спасибо, что посетили Nature.com.Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Методы ферментативной близлежащей маркировки, основанные на активированных эфирах или феноксирадикалах, широко используются для картирования субклеточных протеомов и белковых интеракторов в живых клетках.Однако активированные сложные эфиры менее реакционноспособны, что приводит к широкому радиусу мечения, а феноксирадикалы, образующиеся при обработке пероксидом, могут мешать окислительно-восстановительным путям.Здесь мы сообщаем о методе фотоактивации, зависящей от маркировки близости (PDPL), разработанном путем генетического связывания белка фотосенсибилизатора miniSOG с интересующим белком.Запускаемый синим светом и контролируемый временем воздействия, генерируется синглетный кислород, а затем достигается пространственно-временное разрешение мечения остатков гистидина анилиновым зондом.Мы демонстрируем его высокую точность посредством картирования протеома, специфичного для органелл.Параллельное сравнение PDPL с TurboID показывает более конкретное и всестороннее протеомное покрытие PDPL.Затем мы применили PDPL к связанному с заболеванием транскрипционному коактиватору BRD4 и паркинлигазе E3 и обнаружили ранее неизвестные интеракторы.Путем скрининга избыточной экспрессии два неизвестных субстрата, Ssu72 и SNW1, были идентифицированы для Parkin, деградация которого опосредована убиквитинированием-протеасомным путем.
Точная характеристика белковых сетей лежит в основе многих фундаментальных клеточных процессов.Следовательно, высокоточное пространственно-временное картирование белковых взаимодействий обеспечит молекулярную основу для расшифровки биологических путей, патологии болезни и нарушения этих взаимодействий в терапевтических целях.С этой целью очень желательны методы, способные обнаруживать временные взаимодействия в живых клетках или тканях.Масс-спектрометрия с аффинной очисткой (AP-MS) исторически использовалась для идентификации партнеров по связыванию представляющих интерес белков (POI).С развитием методов количественной протеомики была создана Bioplex3.0, крупнейшая база данных белковых сетей на основе AP-MS.Хотя AP-MS является очень мощным, этапы лизиса и разбавления клеток в рабочем процессе смещены в сторону слабых и временных взаимодействий связывания и вносят артефакты после лизиса, такие как пары ложных взаимодействий, которым не хватает компартментализации до лизиса.
Для решения этих проблем были разработаны неприродные аминокислоты (UAA) со сшивающими группами и платформы ферментативного мечения рядом (PL) (например, APEX и BioID)5.Хотя метод UAA успешно применяется во многих сценариях и предоставляет информацию о прямых белковых адгезивах, по-прежнему требуется оптимизация места вставки UAA.Что еще более важно, это стехиометрический метод мечения, в котором отсутствует каталитическое обращение событий мечения.Напротив, ферментативные методы PL, такие как метод BioID, объединяют сконструированную биотинлигазу с POI7, которая впоследствии активирует биотин с образованием реактивного промежуточного сложного эфира биотинил-АМФ.Таким образом, фермент катализирует и высвобождает активированное биотиновое «облако», которое метит проксимальные остатки лизина.Однако BioID требует более 12 часов для получения достаточного меченого сигнала, что исключает его использование с временным разрешением.Используя направленную эволюцию на основе дрожжевого дисплея, TurboID был разработан на основе BioID, чтобы быть более эффективным, позволяя эффективно маркировать биотином в течение 10 минут, позволяя изучать более динамичные процессы.Поскольку TurboID обладает высокой активностью, а уровни эндогенного биотина достаточны для мечения на низком уровне, фоновое мечение становится потенциальной проблемой, когда требуется сильно усиленное и синхронизированное мечение за счет добавления экзогенного биотина.Кроме того, активированные сложные эфиры плохо реагируют (t1/2 ~5 мин), что может привести к большому радиусу мечения, особенно после насыщения соседних белков биотином 5. В другом подходе генетическое слияние сконструированной аскорбатпероксидазы (т.е. биотин- фенольных радикалов и позволяет маркировать белки в течение одной минуты 9, 10. APEX широко используется для идентификации субклеточных протеомов, мембранных белковых комплексов и цитозольных сигнальных белковых комплексов 11, 12. Однако потребность в высоких концентрациях пероксидов может влиять на окислительно-восстановительные белки или пути, нарушая клеточные процессы.
Таким образом, новый метод, способный генерировать более реактивные виды подавления меченого радиуса с высокой пространственной и временной точностью без значительного нарушения клеточных путей, станет важным дополнением к существующим методам. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Среди активных форм особое внимание привлекают синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 мкс）而引起了我们的注意13』 1/2 < 0,6 мкс）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках).Сообщалось, что синглетный кислород случайным образом окисляет метионин, тирозин, гистидин и триптофан, делая его полярным 14,15 для присоединения к зондам на основе аминов или тиолов16,17.Хотя синглетный кислород использовался для маркировки РНК субклеточного компартмента, стратегии повторного использования эндогенных маркеров близости POI остаются неизученными.Здесь мы представляем платформу, называемую фотоактивационно-зависимой маркировкой близости (PDPL), где мы используем синий свет для освещения POI, слитых с фотосенсибилизатором miniSOG, и запускаем генерацию синглетного кислорода для окисления проксимальных остатков с последующими аминосодержащими модификациями для окисления химических зондов в промежуточные живые клетки..Мы протестировали группу химических зондов, чтобы максимизировать специфичность тегов, и определили сайты модификаций, используя открытый рабочий процесс протеомики.Параллельное сравнение PDPL с TurboID показывает более конкретное и всестороннее протеомное покрытие PDPL.Мы применили этот подход к органелл-специфическим маркерам субклеточного протеома и к общей протеомной идентификации партнеров по связыванию эпигенетического регуляторного белка BRD4, ассоциированного с раком, и лигазы Е3 паркина, ассоциированной с болезнью Паркинсона, что подтвердило как известную, так и неизвестную сеть белка. взаимодействия..Способность PDPL распознавать субстраты E3 в больших белковых комплексах представляет собой ситуацию, когда требуется распознавание непрямых связывателей.Два неизвестных субстрата паркина, опосредованные убиквитинированием протеасомы, были подтверждены in situ.
Фотодинамическая терапия (PDT)19 и лазерная инактивация с помощью хромофора (CALI)20, при которых световое облучение фотосенсибилизаторами генерирует синглетный кислород, могут инактивировать белки-мишени или вызывать гибель клеток.Поскольку синглетный кислород является высокореактивным веществом с теоретическим расстоянием диффузии около 70 нм, можно контролировать пространственно ограниченное окисление вокруг фотосенсибилизатора.Основываясь на этой концепции, мы решили использовать синглетный кислород для достижения близкого мечения белковых комплексов в живых клетках.Мы разработали хемопротеомный подход PDPL для выполнения четырех функций: (1) катализировать генерацию активного синглетного кислорода, аналогично ферментативному подходу PL;(2) обеспечить маркировку с временным разрешением при инициации света;(3) путем изменения (4) Избегайте использования эндогенных кофакторов (таких как биотин) для снижения фона или используйте сильно возмущающие экзогенные реагенты (такие как пероксиды) для минимизации воздействия на клетки стресса окружающей среды.
Фотосенсибилизаторы можно разделить на две категории, включая низкомолекулярные флуорофоры (например, бенгальская роза, метиленовый синий)22 и генетически кодируемые малые белки (например, miniSOG, KillerRed)23.Для достижения модульной конструкции мы разработали платформу PDPL первого поколения, добавив белки фотосенсибилизатора (PS) к POI24,25 (рис. 1а).При облучении синим светом синглетный кислород окисляет проксимальные нуклеофильные аминокислотные остатки, что приводит к полярности умполунга, которая является электрофильной и может в дальнейшем реагировать с аминозондовыми нуклеофилами16,17.Зонд разработан с алкиновой рукояткой, позволяющей проводить химию щелчков и опускаться для характеристики ЖХ/МС/МС.
Схематическая иллюстрация мечения белковых комплексов, опосредованного miniSOG.При воздействии синего света клетки, экспрессирующие miniSOG-POI, генерируют синглетный кислород, который модифицирует взаимодействующие белки, но не несвязывающиеся белки.Промежуточные продукты фотоокисления перехватываются ретрансляционными метками аминового химического зонда с образованием ковалентных аддуктов.Алкинильная группа на химическом зонде позволяет проводить химию кликов для обогащения методом вытягивания вниз с последующим количественным определением ЖХ-МС/МС.б Химическая структура аминовых зондов 1-4.c Репрезентативный флуоресцентный гель-анализ митохондриальных локализованных miniSOG-опосредованных протеомных маркеров с использованием зондов 1-4 и относительной количественной оценки на основе гель-денситометрии.Отношение сигнала к фону химических зондов оценивали с помощью экспериментов с отрицательным контролем, исключая синий свет, или с использованием клеток HEK293T без экспрессии miniSOG.n = 2 биологически независимых образца.Каждая точка представляет собой биологическую копию.d Репрезентативное обнаружение и количественная оценка PDPL с использованием оптимизированного зонда 3 в присутствии или отсутствии указанных компонентов PDPL, таких как c.n = 3 биологически независимых образца.Каждая точка представляет собой биологическую копию.Осевые линии и усы представляют среднее значение и ± стандартное отклонение.CBB: Кумасси бриллиантовый синий.e Конфокальная визуализация синглетного кислорода с окрашиванием Si-DMA в дальний красный цвет.Масштабная линейка: 10 мкм.Визуализация геля и конфокальные эксперименты были независимо повторены по крайней мере дважды с аналогичными результатами.
Сначала мы проверили способность зрелых фотосенсибилизаторов miniSOG26 и KillerRed23, стабильно экспрессируемых в HEK293T, опосредовать пропаргиламиновую маркировку протеома в качестве химического зонда (дополнительная рис. 1a).Флуоресцентный анализ геля показал, что мечение всего протеома было достигнуто с использованием miniSOG и облучения синим светом, в то время как с помощью KillerRed не наблюдалось видимого продукта мечения.Затем, чтобы улучшить отношение сигнала к фону, мы протестировали набор химических зондов, содержащих анилин (1 и 3), пропиламин (2) или бензиламин (4).Мы наблюдали, что сами клетки HEK293T имели более высокий фоновый сигнал по сравнению с отсутствием синего света, возможно, из-за эндогенного фотосенсибилизатора рибофлавина, флавинмононуклеотида (FMN) 27 . Химические зонды на основе анилина 1 и 3 показали лучшую специфичность: HEK293T, стабильно экспрессирующий miniSOG в митохондриях, демонстрирует более чем 8-кратное увеличение сигнала для зонда 3, в то время как зонд 2, используемый в методе мечения РНК CAP-seq, показывает только ~2,5- кратное увеличение сигнала, вероятно, из-за разного предпочтения реактивности между РНК и белком (рис. 1б, в). Химические зонды на основе анилина 1 и 3 показали лучшую специфичность: HEK293T, стабильно экспрессирующий miniSOG в митохондриях, демонстрирует более чем 8-кратное увеличение сигнала для зонда 3, в то время как зонд 2, используемый в методе мечения РНК CAP-seq, показывает только ~2,5- кратное увеличение сигнала, вероятно, из-за разного предпочтения реактивности между РНК и белком (рис. 1б, в).Химические зонды 1 и 3 на основе анилина показали лучшую специфичность: HEK293T, который стабильно экспрессирует miniSOG в митохондриях, показывает более чем 8-кратное увеличение сигнала для зонда 3, в то время как зонд 2, используемый в методе мечения РНК CAP-seq, только показывает ~ 2,5-кратное увеличение сигнала, вероятно, из-за разного предпочтения реактивности между РНК и белком (рис. 1б, в).基于 苯胺 化学 探针 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， hek293t 在 粒体 中 稳定 表达 表达 表达 ， 3 的 信号 增加> 8 倍 ， 用 于 rna 标记 方法 cap-seq 的 2 仅 ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 化学 探针 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 中 稳定 表达 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 于 于 РНК 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于РНКХимические зонды 1 и 3 на основе анилина имели лучшую специфичность, HEK293T стабильно экспрессировал miniSOG в митохондриях, а зонд 3 имел более чем 8-кратное увеличение сигнала, в то время как зонд 2 для метода мечения РНК CAP-seq показал только ~ 2,5-кратное увеличение.в сигнале, вероятно, из-за разного предпочтения реакции между РНК и белком (рис. 1б, в).Кроме того, были протестированы изомеры зонда 3 и гидразиновые зонды (зонды 5, 6, 7), что подтвердило оптимизацию зонда 3 (дополнительный рисунок 1b, c).Точно так же анализ флуоресценции в геле выявил другие оптимизированные экспериментальные параметры: длину волны облучения (460 нм), концентрацию химического зонда (1 мМ) и время облучения (20 мин) (дополнительные рис. 2a – c).Исключение любого компонента или шага в протоколе PDPL привело к значительному обращению сигнала к фону (рис. 1d).Примечательно, что мечение белка было значительно снижено в присутствии азида натрия или тролокса, которые, как известно, гасят синглетный кислород.Присутствие D2O, который, как известно, стабилизирует синглетный кислород, усиливает сигнал мечения.Чтобы исследовать вклад других активных форм кислорода в мечение, были добавлены маннит и витамин С, чтобы установить поглотители гидроксильных и супероксидных радикалов, соответственно, 18, 29, но не было обнаружено, что они уменьшают мечение.Добавление H2O2, но не освещение, не привело к маркировке (дополнительный рис. 3a).Флуоресцентная визуализация синглетного кислорода с зондами Si-DMA подтвердила наличие синглетного кислорода в проводе HEK293T-miniSOG, но не в исходном проводе HEK293T.Кроме того, mitoSOX Red не смог обнаружить выработку супероксида после освещения (рис. 1e и дополнительная рис. 3b) 30. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что синглетный кислород является основным активным видом кислорода, ответственным за последующую протеомную маркировку.Цитотоксичность PDPL оценивали, включая облучение синим светом и химические зонды, и значительной цитотоксичности не наблюдалось (дополнительная рис. 4a).
Чтобы изучить механизм мечения и обеспечить протеомную идентификацию белковых комплексов с помощью ЖХ-МС/МС, нам сначала необходимо определить, какие аминокислоты модифицированы, и дельта-массу меток зондов.Сообщалось, что метионин, гистидин, триптофан и тирозин модифицируются синглетным кислородом14,15.Мы интегрируем рабочий процесс TOP-ABPP31 с беспристрастным открытым поиском, предоставляемым вычислительной платформой FragPipe на базе MSFragger32.После модификации синглетным кислородом и мечения химическим зондом была проведена клик-химия с использованием метки для восстановления биотина, содержащей расщепляемый линкер, с последующим растяжением нейтравидином и расщеплением трипсином.Модифицированный пептид, все еще связанный со смолой, был фоторасщеплен для анализа ЖХ-МС/МС (рис. 2а и дополнительные данные 1).Большое количество модификаций произошло по всему протеому с перечислением более 50 совпадений пептидной карты (PSM) (рис. 2b).Удивительно, но мы наблюдали модификацию только гистидина, вероятно, из-за более высокой реактивности окисленного гистидина по отношению к анилиновым зондам, чем другие аминокислоты.Согласно опубликованному механизму окисления гистидина синглетным кислородом,21,33 предполагаемая дельта-массовая структура +229 Да соответствует аддукту зонда 3 с 2-оксогистидином после двух окислений, а +247 Да является продуктом гидролиза +229 Да (дополнительный рис. 5).Оценка спектра МС2 показала высокую достоверность идентификации большинства ионов у и b, в том числе идентификации модифицированных фрагментных ионов (у и b) (рис. 2в).Контекстный анализ локальной последовательности гистидинов, модифицированных PDPL, выявил умеренное предпочтение мотивов небольшим гидрофобным остаткам в положениях ± 1 (дополнительная рис. 4b).В среднем на белок было идентифицировано 1,4 гистидина, а сайты этих маркеров были определены с помощью анализа доступной для растворителя площади поверхности (SASA) и относительной доступности растворителя (RSA) (дополнительная рис. 4c, d).
Беспристрастный рабочий процесс для изучения остаточной селективности с использованием вычислительной платформы FragPipe на базе MSFragger.Расщепляемые линкеры используются в Click-химии, чтобы сделать возможным фотоотщепление модифицированных пептидов от стрептавидиновой смолы.Был начат открытый поиск по выявлению многочисленных модификаций, а также соответствующих остатков.b Определите массу модификаций, происходящих в протеоме.Пептидное картирование PSM.c Спектральная аннотация MS2 гистидиновых сайтов, модифицированных зондом 3. В качестве репрезентативного примера ковалентная реакция с зондом 3 добавила +229,0938 Да к модифицированной аминокислоте.d Анализ мутаций, используемый для проверки маркеров PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) и PRDX1 (H10A, H81A, H169A) трансфицировали плазмидами дикого типа для обнаружения анти-Flag.e Синтетический пептид реагировал с очищенным miniSOG в присутствии зонда 3, и в спектре ЖХ-МС были отмечены соответствующие продукты с Δm +247 и +229.f Межбелковые взаимодействия in vitro, смоделированные с помощью miniSOG-6xHis-tag и анти-6xHis-антитела.Антибиотин (стрептавидин-HRP) и антимышиный Вестерн-блот анализ комплексов антител miniSOG-6xHis/анти-6xHis, меченных зондом 3, в зависимости от времени воздействия света.Метки для отдельных белков выражены в соответствующей молекулярной массе: легкая цепь антитела LC, тяжелая цепь антитела HC.Эти эксперименты были независимо повторены по крайней мере дважды с аналогичными результатами.
Для биохимической проверки сайта мечения PRDX3 и PRDX1, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии, заменяли гистидин на аланин и сравнивали с диким типом в анализах трансфекции.Результаты PDPL показали, что мутация значительно снижает мечение (рис. 2d).Между тем, пептидные последовательности, идентифицированные в открытом поиске, были синтезированы и прореагировали in vitro с очищенным miniSOG в присутствии зонда 3 и синего света, дав продукты со сдвигом масс +247 и +229 Да при обнаружении с помощью ЖХ-МС (рис. 2д).).Чтобы проверить, могут ли взаимодействующие проксимальные белки быть помечены in vitro в ответ на фотоактивацию miniSOG, мы разработали анализ искусственной близости путем взаимодействия между белком miniSOG-6xHis и моноклональным антителом против His in vitro (рис. 2f).В этом анализе мы ожидали проксимального мечения тяжелых и легких цепей антител с помощью miniSOG.Фактически, антимышиные (распознающие тяжелые и легкие цепи анти-6xHis-меченого антитела) и стрептавидиновые вестерн-блоты показали сильное биотинилирование тяжелых и легких цепей.Примечательно, что мы заметили аутобиотинилирование miniSOG из-за метки 6xHis и перекрестных связей между легкими и тяжелыми цепями, что может быть связано с ранее описанным разрывом между лизиновым и 2-оксогистидиновым проксимальным ответом.В заключение мы заключаем, что PDPL модифицирует гистидин в зависимости от близости.
Нашей следующей целью было охарактеризовать субклеточный протеом, чтобы проверить специфичность маркировки in situ.Следовательно, мы стабильно экспрессировали miniSOG в ядре, митохондриальном матриксе или внешней мембране ER клеток HEK293T (рис. 3а).Анализ флуоресценции геля выявил множество меченых полос в трех субклеточных местах, а также различные модели мечения (рис. 3b).Анализ флуоресцентной визуализации показал высокую специфичность PDPL (рис. 3с).За рабочим процессом PDPL последовали клик-реакции с родаминовыми красителями для очерчивания субклеточных протеомов с помощью флуоресцентной микроскопии, а сигналы PDPL были локализованы с помощью DAPI, митохондриальных трекеров или трекеров ER, что подтвердило высокую точность PDPL.Для трех мест расположения органелл параллельное сравнение PDPL с TurboID с использованием авидинового вестерн-блоттинга показало, что PDPL был помечен более конкретно по сравнению с их соответствующими контролями.В условиях PDPL появилось больше меченых полос, что указывает на большее количество белков, меченных PDPL (дополнительная рис. 6a-d).
a Схематическое изображение опосредованной miniSOG маркировки специфического для органелл протеома.miniSOG нацеливается на митохондриальный матрикс посредством слияния с N-концевыми 23 аминокислотами COX4 человека (mito-miniSOG), на ядро ​​​​через слияние с H2B (nucleus-miniSOG) и Sec61β через цитоплазматическую сторону мембраны ER (ER-miniSOG). ).Показания включают визуализацию геля, конфокальную визуализацию и масс-спектрометрию.b Репрезентативные изображения геля трех профилей PDPL, специфичных для органелл.CBB Кумасси бриллиантовый синий.c Репрезентативные конфокальные изображения клеток HEK293T, стабильно экспрессирующих miniSOG с различными субклеточными локализациями, обнаруженными с помощью антитела, помеченного V5 (красный).Субклеточные маркеры используются для митохондрий и ER (зеленый).Рабочий процесс PDPL включает в себя обнаружение субклеточных протеомов, помеченных miniSOG (желтым), с использованием химии щелчков Cy3-азида.Масштабная линейка: 10 мкм.d Вулканические графики меченых PDPL протеомов в различных органеллах, количественно определенные с помощью немеченого количественного определения (n = 3 независимых биологических эксперимента).На графиках вулканов использовали двусторонний t-критерий Стьюдента.HEK293T дикого типа использовали в качестве отрицательного контроля. Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Значительно повышенные выделения выделены ярко выраженного цвета (p < 0,05 и >2-кратная разница в концентрации ионов). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05°> 2 Значительно повышенные выделения выделены окрашенного цвета (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе).Родственные белки, важные для HEK293T-miniSOG, но не важные для HEK293T, показаны зеленым цветом.e Анализ специфичности наборов протеомных данных из экспериментов d.Общее количество статистически значимых белков в каждой органелле (красные и зеленые точки) отмечено вверху.Гистограммы показывают белки, локализованные в органеллах, на основе MitoCarta 3.0, анализа GO и A. Ting et al.люди.Отдельные наборы данных для митохондрий, ядер и ЭР.Эти эксперименты были независимо повторены по крайней мере дважды с аналогичными результатами.Необработанные данные предоставляются в виде файлов необработанных данных.
Воодушевленный результатами геля и визуализации, количественная оценка без меток использовалась для количественной оценки идентифицированного протеома в каждой органелле (дополнительные данные 2).Нетрансфицированный HEK293T использовали в качестве отрицательного контроля для вычитания фоновых маркеров. Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Анализ показал, что выявлены богатые углеводы (p <0, 05 и > 2-кратная концентрация ионов), а также одиночные углеводы, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p<0,05 и >2-кратная интенсивность ионов), а также отдельные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки).火山图 分析 显示 显着 富集 的 蛋白质 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 强度） 以及 仅 存 在于 minisog 表达 中 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点 绿色点）。。火山图 分析 显示 显着 的 蛋白质 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 单一 蛋白质 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点 。。。）））））））））））））））） （图 图 红色 。。。 。。。)) Анализ показал, что обнаружены обнаруженные в экспрессионной линии линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p<0,05 и >2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d).Объединив эти данные, мы идентифицировали 1364, 461 и 911 статистически значимых ядерных, митохондриальных и ER белков внешней мембраны соответственно.Чтобы проанализировать точность локализованного в органеллах PDPL, мы использовали MitoCarta 3.0, анализ Gene Ontology (GO) и A. Ting et al.набор данных8 был использован для митохондрий, ядра и ER для проверки специфичности обнаруженных белков к органеллам, что соответствует точности 73,4, 78,5 и 73,0% (рис. 3e).Специфичность PDPL подтверждает, что PDPL является идеальным инструментом для идентификации специфических для органелл протеомов.Примечательно, что субмитохондриальный анализ идентифицированных митохондриальных белков показал, что захваченный протеом был в основном распределен в матриксе и внутренней мембране (226 и 106 соответственно), составляя 91,7% (362) от общего числа идентифицированных митохондриальных белков.дополнительно был подтвержден высокий уровень PDPL (дополнительная рис. 7а).Точно так же субъядерный анализ показал, что захваченный протеом был в основном распределен в ядре, нуклеоплазме и ядрышке (дополнительная рис. 7b).Ядерный протеомный анализ с сигнальным пептидом ядерной локализации (3xNLS) показал точность, аналогичную конструкции H2B (дополнительная рис. 7c – h).Для определения специфичности маркера PDPL ядерный ламинин А был выбран как более дискретно локализованная ловушка POI7.PDPL идентифицировал 36 значительно обогащенных белков, из которых 12 белков (30,0%, включая ламин А) были хорошо охарактеризованными белками, взаимодействующими с ламин А, аннотированными базой данных String, с более высоким процентом, чем метод BioID (122 белка) 28 из 28. , 22,9 %) 7. Наш метод идентифицировал меньше белков, возможно, из-за ограниченных областей мечения, что стало возможным благодаря более активному синглетному кислороду.Анализ ГО показал, что идентифицированные белки в основном располагались в нуклеоплазме (26), ядерной мембране (10), ядерной мембране (9) и ядерных порах (5).В совокупности на эти локализованные в ядре белки приходилось 80% обогащенных белков, что еще раз демонстрирует специфичность PDPL (дополнительная рис. 8a – d).
Установив способность PDPL выполнять маркировку близости в органеллах, мы затем проверили, можно ли использовать PDPL для анализа партнеров по связыванию POI.В частности, мы стремились определить PDPL-анализ цитозольных белков, которые считаются более сложными мишенями, чем их аналоги, локализованные в мембране, из-за их высокодинамичной природы.Бромодомен и экстратерминальный (BET) белок BRD4 привлек наше внимание своей ключевой ролью в различных заболеваниях 35, 36 .Комплекс, образованный BRD4, является коактиватором транскрипции и важной терапевтической мишенью.Регулируя экспрессию факторов транскрипции c-myc и Wnt5a, BRD4 считается ключевым фактором, определяющим острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), множественную миелому, лимфому Беркитта, рак толстой кишки и воспалительные заболевания37,38.Кроме того, некоторые вирусы нацелены на BRD4 для регуляции вирусной и клеточной транскрипции, например вирусы папилломы, ВИЧ и SARS-CoV-236,39.
Чтобы сопоставить взаимодействие BRD4 с использованием PDPL, мы объединили miniSOG с короткой N- или C-концевой изоформой BRD4.Протеомные результаты выявили высокую степень перекрытия между двумя конструкциями (дополнительная рис. 9а).Ядерный протеом, идентифицированный с помощью miniSOG-H2B, покрывает 77,6% белков, взаимодействующих с BRD4 (дополнительная рис. 9b).Затем для регулировки радиуса маркера использовали разное время освещения (2, 5, 10, 20 мин) (рис. 4а и дополнительные данные 3).Мы пришли к выводу, что при более коротких фотопериодах PDPL будет в первую очередь метить партнеров прямого связывания, тогда как более длительные периоды будут включать белки, идентифицированные при более коротких периодах фотоактивации, а также непрямые мишени в комплексах мечения.Фактически, мы обнаружили сильное перекрытие между соседними временными точками (84,6% для 2 и 5 минут; 87,7% для 5 и 10 минут; 98,7% для 10 и 20 минут) (рис. 4b и дополнительная рис. 9c).Во всех экспериментальных группах мы обнаружили не только самомаркирующийся BRD4, но и несколько известных мишеней, таких как MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A и HMGB1, аннотированных в базе данных строк.Ионная сила этих целей пропорциональна времени воздействия (рис. 4c и дополнительный рис. 9d).GO-анализ белков, идентифицированных в 2-минутной группе, показал, что идентифицированные белки были локализованы в ядре и участвовали в ремоделировании хроматина и функционировании РНК-полимеразы.Молекулярная функция белка была обогащена связыванием хроматина или коактивацией транскрипции, что согласуется с функцией BRD4 (Fig. 4d).Анализ взаимодействия белков с поддержкой базы данных строк выявил первый уровень непрямых взаимодействий между взаимодействующими комплексами семейства BRD4 и HDAC, такими как SIN3A, NCOR2, BCOR и SAP130 (рис. 4e и дополнительная рис. 9e), что согласуется с тем, что BRD4 и HDAC связывают ацетилированные гистоны. ..Кроме того, репрезентативные мишени, идентифицированные с помощью ЖХ-МС/МС, включая Sin3A, NSUN2, Fus и SFPQ, были подтверждены вестерн-блоттингом (рис. 4f).Недавно сообщалось, что короткая изоформа BRD4 образует ядра со свойствами разделения фаз жидкость-жидкость (LLPS).РНК-связывающие белки Fus и SFPQ опосредуют LLP различных клеточных процессов и были идентифицированы здесь как незарегистрированные белки, связывающие BRD4.Взаимодействие между BRD4 и SFPQ было подтверждено экспериментами по ко-иммунопреципитации (co-IP) (рис. 4g), что свидетельствует о другом механизме опосредованного BRD4 разделения фаз жидкость-жидкость, заслуживающем дальнейшего изучения.В совокупности эти результаты позволяют предположить, что PDPL является идеальной платформой для идентификации известных белков, взаимодействующих с BRD4, а также неизвестных связывающих белков.
a Схематическое изображение опосредованной miniSOG маркировки близости BRD4, время воздействия: 2, 5, 10 и 20 мин.b Перекрытие белков, идентифицированных при разном времени освещения.Обогащение белка, выявленное в HEK293T-miniSOG-BRD4, было статистически значимым по сравнению с HEK293T дикого типа.c Интенсивность ионов при количественном определении немеченых репрезентативных известных BRD4-связывающих белков в течение указанного времени воздействия.n = 3 биологически независимых образца.Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение.d Генный онтологический анализ (GO) белков, идентифицированных в 2-минутной группе.Перечислены первые десять терминов GO.Пузырьки окрашены в соответствии с категорией терминов GO, а размер пузырьков пропорционален количеству белков, обнаруженных в каждом термине.д Строковый анализ белков, взаимодействующих с BRD4.Желтые круги — это прямой клей, а серые круги — первый слой непрямого клея.Красные линии представляют экспериментально определенные взаимодействия, а синие линии представляют предсказанные взаимодействия.f Репрезентативные мишени связывания BRD4, идентифицированные в ЖХ-МС/МС, были подтверждены вестерн-блоттингом.g Эксперименты по совместной иммунопреципитации подтверждают взаимодействие между SFPQ и BRD4.Эти эксперименты были независимо повторены по крайней мере дважды с аналогичными результатами.Необработанные данные предоставляются в виде файлов необработанных данных.
В дополнение к идентификации незарегистрированных мишеней, связанных с POI, мы предполагаем, что PDPL будет подходящим для идентификации субстратов для ферментов, что потребует характеристики непрямых связывающих белков в больших комплексах для аннотирования незарегистрированных субстратов.Паркин (кодируемый PARK2) представляет собой лигазу E3, и известно, что мутации в паркине вызывают аутосомно-рецессивную ювенильную болезнь Паркинсона (AR-JP)42.Кроме того, было описано, что паркин необходим для митофагии (митохондриальной аутофагии) и удаления активных форм кислорода.Однако, хотя было идентифицировано несколько субстратов паркина, роль паркина в этом заболевании остается неясной.Чтобы аннотировать его неохарактеризованные субстраты, PDPL тестировали путем добавления miniSOG к N- или C-концу паркина.Клетки обрабатывали переносчиком протонов карбонилцианида м-хлорфенилгидразоном (CCCP) для активации паркина через путь PINK1-Parkin.По сравнению с нашими результатами BRD4 PDPL, слияние N-конца паркина выявило больший набор белков-мишеней, хотя оно охватывало большую часть C-конца (177 из 210) (рис. 5a, b и дополнительные данные 4).результат согласуется с сообщениями о том, что N-концевые метки могут аберрантно активировать Parkin44.Удивительно, но в наших данных с опубликованными результатами AP-MS для Parkin43 было только 18 перекрывающихся белков, вероятно, из-за различий между клеточными линиями и рабочими процессами протеомики.В дополнение к четырем известным белкам (ARDM1, HSPA8, PSMD14 и PSMC3), идентифицированным двумя методами (рис. 5в)43.Для дальнейшей проверки результатов LC-MS/MS, обработки PDPL и последующего вестерн-блоттинга использовали для сравнения результатов анализа родительских клеток HEK293T и стабильной линии N-концевого паркина.Ранее неизвестные мишени CDK2, DUT, CTBP1 и PSMC4 тестировали с известным связующим, DNAJB1 (рис. 5d).
Вулканический график белков, взаимодействующих с паркином, в клетках HEK293T со стабильно экспрессируемым miniSOG, слитым с N- или C-концом паркина (n = 3 независимых биологических эксперимента).На графиках вулканов использовали двусторонний t-критерий Стьюдента.HEK293T использовали в качестве отрицательного контроля. Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Значительно повышенные выделения выделены ярко выраженного цвета (p < 0,05 и >2-кратная разница в концентрации ионов). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05°> 2 Значительно повышенные выделения выделены окрашенного цвета (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе).Родственные белки, важные для HEK293T-miniSOG, но не важные для HEK293T, показаны зеленым цветом.b Диаграмма Венна, показывающая перекрывающиеся белки между N-концевыми и C-концевыми конструкциями.N-концевые метки могут аберрантно активировать паркин и приводить к более узнаваемым белкам.c Диаграмма Венна, показывающая перекрывающиеся белки между PDPL и AP-MS.Перечислены известные интеракторы, включая 4 из 18 перекрывающихся белков и 11 из 159 белков, специально идентифицированных в PDPL.d Репрезентативные мишени, идентифицированные с помощью ЖХ-МС/МС, были проверены вестерн-блоттингом.e Ssu72 и SNW1 были идентифицированы как незарегистрированные субстраты паркина.Эти меченные FLAG белковые плазмиды трансфицировали в HEK293T и HEK293T-Parkin-miniSOG с последующей обработкой CCCP в различные моменты времени.Деградация была более выраженной в линии сверхэкспрессии Parkin.f Используя протеасомный ингибитор MG132, было подтверждено, что процесс деградации Ssu72 и SNW1 опосредован протеасомным убиквитинированием.Эти эксперименты были независимо повторены по крайней мере дважды с аналогичными результатами.Необработанные данные предоставляются в виде файлов необработанных данных.
Примечательно, что белки, идентифицируемые с помощью PDPL, должны включать паркин-связывающие белки и их субстраты.Для обнаружения незарегистрированных субстратов паркина мы выбрали семь идентифицированных белков (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 и SNW1) и трансфицированные плазмиды, чтобы подвергнуть эти гены воздействию нормального HEK293T и стабильно экспрессировать miniSOG-Parkin's HEK293T с последующей обработкой CCCP.Уровни белков Ssu72 и SNW1 были значительно снижены в стабильной линии miniSOG-Parkin (рис. 5e).Обработка CCCP в течение 12 часов приводила к наиболее значительной деградации обоих субстратов.Чтобы исследовать, регулируется ли деградация Ssu72 и SNW1 протеасомным убиквитинированием, был добавлен ингибитор протеасом MG132 для ингибирования протеасомной активности, и фактически мы обнаружили, что процесс их деградации был ингибирован (рис. 5f).Дополнительные несубстратные мишени были подтверждены как взаимодействующие с паркином с помощью вестерн-блоттинга (дополнительная рис. 10), который показал согласующиеся результаты с LC-MS/MS.В заключение, интеграция рабочего процесса PDPL с проверкой трансфекции целевого белка позволяет идентифицировать незарегистрированные субстраты лигазы E3.
Мы разработали общую платформу маркировки близости, которая позволяет идентифицировать в пространстве и времени взаимодействующие POI.Платформа основана на белке-фотосенсибилизаторе miniSOG, который составляет всего около 12 кДа, что составляет менее половины размера зрелого фермента APEX2 (27 кДа) и одну треть размера TurboID (35 кДа).Меньший размер должен значительно расширить спектр приложений для изучения небольших белковых интерактомов.Дальнейшее исследование дополнительных фотосенсибилизаторов, будь то генетически кодируемые белки или небольшие молекулы, необходимо для увеличения квантового выхода синглетного кислорода и расширения чувствительности этого подхода.Для текущей версии miniSOG высокое временное разрешение может быть достигнуто с помощью синей подсветки для активации маркеров приближения.Кроме того, при более длительном воздействии высвобождается большее «облако» синглетного кислорода, что приводит к модификации более дистальных остатков гистидина, увеличению радиуса мечения и возможности точной настройки пространственного разрешения PDPL.Мы также протестировали семь химических зондов, чтобы увеличить отношение сигнала к фону, и исследовали молекулярный механизм, стоящий за этим подходом.Рабочий процесс TOP-ABPP в сочетании с беспристрастным открытым поиском подтвердил, что модификации происходили только в гистидинах, и не наблюдалось постоянного микроокружения для повышенных модификаций гистидина, за исключением умеренного предпочтения гистидинов в области петли.
PDPL также использовался для характеристики субклеточных протеомов с протеомной специфичностью и охватом, по крайней мере, сравнимым с другими методами маркировки близости и специфичных для органелл химических зондов.Маркеры близости также успешно использовались для характеристики поверхностных, лизосомных и связанных с секретомом протеомов46,47.Мы считаем, что PDPL будет совместим с этими субклеточными органеллами.Кроме того, мы бросили вызов PDPL, идентифицировав мишени для связывания цитозольных белков, которые являются более сложными, чем белки, связанные с мембраной, из-за их динамических свойств и участия в более временных взаимодействиях.PDPL применяли к двум белкам, транскрипционному коактиватору BRD4 и связанной с заболеванием лигазе E3 Parkin.Эти два белка были выбраны не только из-за их фундаментальных биологических функций, но также из-за их клинической значимости и терапевтического потенциала.Для этих двух POI были идентифицированы хорошо известные партнеры по связыванию, а также незарегистрированные мишени.Примечательно, что белок SFPQ, ассоциированный с разделением фаз, был подтвержден co-IP, что может указывать на новый механизм, с помощью которого BRD4 (короткая изоформа) регулирует LLPS.В то же время мы считаем, что идентификация субстратов паркина является сценарием, в котором требуется идентификация непрямых адгезивов.Мы идентифицировали два неидентифицированных субстрата паркина и подтвердили их деградацию по пути убиквитинирования-протеасомы.Недавно была разработана стратегия захвата, основанная на механизме, для обнаружения субстратов гидролазы путем их захвата ферментами.Хотя это очень мощный метод, он не подходит для анализа субстратов, участвующих в образовании больших комплексов, и требует образования ковалентных связей между ферментом и субстратом.Мы ожидаем, что PDPL может быть расширен для изучения других белковых комплексов и семейств ферментов, таких как семейства деубиквитиназ и металлопротеаз.
Новая форма miniSOG, названная SOPP3, была разработана с улучшенным производством синглетного кислорода.Мы сравнили miniSOG с SOPP3 и обнаружили улучшенную производительность маркировки, хотя отношение сигнал/шум осталось неизменным (дополнительная рис. 11).Мы предположили, что оптимизация SOPP3 (например, посредством направленной эволюции) приведет к более эффективным белкам-фотосенсибилизаторам, которые требуют более короткого времени освещения и, таким образом, позволят улавливать более динамичные клеточные процессы.Примечательно, что текущая версия PDPL ограничена клеточной средой, поскольку требует освещения синим светом и не может проникать в глубокие ткани.Эта особенность исключает его использование в исследованиях на животных моделях.Однако сочетание оптогенетики с PDPL может дать возможность для исследований на животных, особенно в головном мозге.Кроме того, другие инженерные инфракрасные фотосенсибилизаторы также снимают это ограничение.В настоящее время ведутся исследования в этой области.
Линия клеток HEK293T была получена от ATCC (CRL-3216).Клеточная линия дала отрицательный результат на микоплазменную инфекцию и была культивирована в среде DMEM (Thermo, #C11995500BT) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, Vistech, #SE100-B) и 1% пенициллина/стрептомицина (Hyclone, #SV30010).вырос в.
3-Аминофенилен (образец 3) и (4-этинилфенил)метанамин (образец 4) были приобретены у Bidepharm.Пропиламин (зонд 2) был приобретен у Energy-chemicals.N-(2-Аминофенил)пент-4-инамид (зонд 1) синтезировали согласно опубликованным методикам.
В дополнительной таблице 1 перечислены генетические конструкции, использованные в этом исследовании.Последовательности miniSOG и KillerRed были клонированы из подарочной плазмиды P. Zou (Пекинский университет).Последовательность нацеливания на митохондриальный матрикс была получена из 23 N-концевых аминокислот COX4 и клонирована в указанные векторы с использованием сборки Gibson (Beyotime, #D7010S).Для нацеливания на мембрану и ядро ​​эндоплазматического ретикулума ДНК человека SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L), амплифицированную с помощью ПЦР, из библиотеки кДНК клеток HEK293T, и ДНК H2B (предоставлена ​​Д. Лином, Лаборатория Шэньчжэньского залива). и клонированные, как упоминалось выше.Если не указано иное, другие гены белка, используемые для трансфекции и конструирования стабильных клеточных линий, амплифицировали с помощью ПЦР из библиотеки кДНК клеток HEK293T.G3S (GGGS) и G4S (GGGGS) использовали в качестве линкеров между белком-приманкой и miniSOG.К этим конструкциям слияния добавляли метку эпитопа V5 (GKPIPNPLLGLDST).Для экспрессии у млекопитающих и создания стабильной клеточной линии слитую конструкцию miniSOG субклонировали в лентивирусный вектор pLX304.Для бактериальной экспрессии miniSOG клонировали в вектор pET21a, меченный 6xHis на С-конце.
Клетки HEK293T высевали по 2,0 x 105 клеток на лунку в шестилуночные планшеты и через 24 часа трансфицировали рекомбинантными лентивирусными плазмидами (2,4 мкг pLX304) и плазмидами для упаковки вирусов (1,5 мкг psPAX2 и 1,2 мкг pMD2.G) с использованием Lipo8000 (Beyotime , #C0533), сплав около 80%.После ночной трансфекции среду меняли и инкубировали еще 24 часа.Сбор вируса проводили через 24, 48 и 72 часа.Перед заражением целевых клеточных линий вирусную среду фильтровали через фильтр 0,8 мкм (Merck, #millex-GP) и добавляли полибрен (Solarbio, #H8761) до концентрации 8 мкг/мл.Через 24 часа клеткам давали возможность восстановиться путем замены среды.Клетки отбирали с использованием 5 мкг/мл бластицидина (Solarbio, #3513-03-9) для первых трех пассажей в качестве менее жесткой селекции.Затем использовали 20 мкг/мл как более строгий режим для следующих трех пассажей.
Клетки высевали в 12-луночные камеры (Ibidi, #81201) при плотности примерно 20000 клеток на лунку.Чтобы улучшить адгезию клеток HEK293T, добавьте 50 мкг/мл фибронектина (Corning, #356008), разведенного в фосфатно-солевом буфере (PBS, Sangon, #B640435) при 37°C.Камеры предварительно обрабатывали в течение 1 часа, а затем удаляли PBS.Через 24 ч клетки однократно промывали PBS, инкубировали с 1 мМ зондом 3 в свежем сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS, Gibco, #14025092) в течение 1 ч при 37°C, а затем инкубировали с синим светодиодом (460 нм). ).) облучали в течение 10 мин при комнатной температуре.После этого клетки дважды промывали PBS и фиксировали 4% формальдегидом в PBS (Sangon, #E672002) в течение 15 минут при комнатной температуре.Избыток формальдегида удаляли из фиксированных клеток путем трехкратной промывки PBS.Затем клетки пермеабилизировали 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) в PBS и промывали 3 раза PBS.Затем снимите камеру и добавьте к каждому образцу по 25 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мкМ Cy3-азида (Aladdin, #C196720), 2 мМ CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 мМ BTTAA (Confluore, #BDJ-4). и 0,5 мг/мл аскорбата натрия (Aladdin, № S105024) и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре.После быстрой реакции клетки шесть раз промывали PBS, содержащим 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST), а затем блокировали 5% BSA (Abcone, #B24726) в PBST в течение 30 минут при комнатной температуре.
Для колокального иммуноокрашивания клетки инкубировали с первичными антителами в соответствии с указанными условиями: mAb мыши против V5 tag (1:500, CST, #80076), mAb кролика против Hsp60 (1:1000), ABclonal, #A0564), кроличье поликлональное антитело против калнексина (1:500, Abcam, #ab22595) или кроличье моноклональное антитело против ламина A/C (1:500; CST, #2032) при 4°C в течение ночи.После трехкратной промывки PBST клетки инкубировали со вторичными антителами: козьими антикроличьими Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) в разведении 1:1000, козьими антимышиными Alexa Fluor 594 (CST, #8889) в разведении 1:1000.разбавление Развести при комнатной температуре в течение 30 минут.Затем клетки промывали 3 раза PBST и докрашивали DAPI (Thermo, #D1306) в PBS в течение 10 минут при комнатной температуре.После 3 промывок PBS клетки запечатывали в 50% глицерине (Sangon, #A600232) в PBS для визуализации.Иммунофлуоресцентные изображения получали с помощью конфокального микроскопа ZEISS LSM 900 Airyscan2 и программного обеспечения ZNE 3.5.
Для флуоресцентной визуализации синглетного кислорода клетки дважды промывали буфером Hanks HEPES перед добавлением 100 нМ Si-DMA в буфере Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).После воздействия света клетки инкубировали в СО2-инкубаторе при 37°С в течение 45 минут.Затем клетки дважды промывали буфером Хэнкса HEPES и контрастно окрашивали Hoechst в буфере Хэнкса HEPES в течение 10 минут при комнатной температуре и визуализировали с использованием конфокального микроскопа ZEISS LSM 900., #M36008) в буфере HBSS, содержащем кальций и магний.После воздействия света или доксорубицина (MCE, #HY-15142A) клетки инкубировали в CO2-инкубаторе при 37°C в течение 10 минут, дважды промывали буфером HBSS и инкубировали с Hoechst в буфере HBSS при комнатной температуре.минут.Доксорубицин использовали в качестве положительного контроля зонда, когда клетки обрабатывали 20 мкМ доксорубицина в HBSS, содержащем 1% BSA, в течение 30 минут.Иммунофлуоресцентные изображения получали с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM 900.
Клетки HEK293T, стабильно экспрессирующие мито-miniSOG, высевали с плотностью приблизительно 30% в чашки диаметром 15 см.Через 48 часов, когда было достигнуто ~80% слияние, клетки однократно промывали PBS, инкубировали с 1 мМ Probe 3 в свежем буфере HBSS в течение 1 часа при 37°C, а затем освещали синим светодиодом в течение 10 минут при комнатной температуре. температура..После этого клетки дважды промывали PBS, соскабливали и ресуспендировали в охлажденном льдом буфере PBS, содержащем ингибиторы протеазы, не содержащие ЭДТА (MCE, #HY-K0011).Клетки лизировали путем обработки наконечника ультразвуком в течение 1 минуты (1 секунда включена и 1 секунда выключена при амплитуде 35%).Полученную смесь центрифугировали при 15 871 x g в течение 10 мин при 4°C для удаления дебриса, а концентрацию надосадочной жидкости доводили до 4 мг/мл с помощью набора для анализа белка BCA (Beyotime, #P0009).Объедините 1 мл вышеуказанного лизата с 0,1 мМ фоторазлагаемого азида биотина (Confluore, #BBBD-14), 1 мМ TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 мМ лиганда TBTA (Aladdin, #T162437) и 1 мМ CuSO4. Инкубатор с дном вращение в течение 1 часа при комнатной температуре.После быстрой реакции добавьте смесь к предварительно перемешанному раствору (MeOH:CHCl3:H2O = 4 мл:1 мл:3 мл) в стеклянном флаконе на 10 мл.Образцы перемешивали и центрифугировали при 4500 g в течение 10 минут при комнатной температуре.Нижний и верхний растворы отбрасывали, осадок дважды промывали 1 мл метанола и центрифугировали при 15871×g 5 мин при 4°С.Добавьте 1 мл 8 М мочевины (Aladdin, № U111902) в 25 мМ бикарбоната аммония (ABC, Aladdin, № A110539), чтобы растворить осадок.Образцы восстанавливали 10 мМ дитиотреитола (Sangon, #A100281 в 25 мМ ABC) в течение 40 минут при 55°C с последующим добавлением 15 мМ свежего йодацетамида (Sangon, #A600539) при комнатной температуре в темноте.Алкилирование в течение 30 минут..Для остановки реакции добавляли дополнительно 5 мМ дитиотреитола.Подготовьте приблизительно 100 мкл агарозных гранул NeutrAvidin (Thermo, #29202) для каждого образца, промыв 3 раза 1 мл PBS.Указанный выше раствор протеома разбавляли 5 мл PBS и инкубировали с предварительно промытыми гранулами агарозы NeutrAvidin в течение 4 часов при комнатной температуре.Затем шарики промывали 3 раза 5 мл PBS, содержащего 0,2% SDS (Sangon, #A600485), 3 раза 5 мл PBS, содержащего 1M мочевину, и 3 раза 5 мл ddH2O.Затем шарики собирали центрифугированием и ресуспендировали в 200 мкл 25 мМ ABC, содержащего 1 М мочевины, 1 мМ CaCl 2 (Macklin, #C805228) и 20 нг/мкл трипсина (Promega, #V5280).Трипсинизируют в течение ночи при 37°С с вращением.Реакцию останавливали добавлением муравьиной кислоты (Thermo, # A117-50) до тех пор, пока pH не достигал 2-3.Гранулы промывали 3 раза 1 мл PBS, содержащего 0,2% SDS, 3 раза 1 мл PBS, содержащего 1 М мочевину, а затем 3 раза 1 мл дистиллированной воды.Модифицированные пептиды высвобождали световым лизисом (365 нм) в течение 90 мин с использованием 200 мкл 70% MeOH.После центрифугирования собирали супернатант.Затем гранулы один раз промывали 100 мкл 70% MeOH и супернатанты объединяли.Образцы сушили в вакуумном концентраторе Speedvac и хранили при -20°C до проведения анализа.
Для идентификации и количественного определения пептидов, модифицированных синглетным кислородом, образцы повторно растворяли в 0,1% муравьиной кислоте и 1 мкг пептидов анализировали с использованием масс-спектрометра Orbitrap Fusion Lumos Tribrid, оснащенного источником nano ESI от Tune и Xcalibur из программного обеспечения поставщика 4.3.Образцы разделяли на капиллярной колонке 75 мкм × 15 см с внутренней насадкой с материалом C18 3 мкм (ReproSil-pur, #r13.b9.) и подключали к системе EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Пептиды разделяли линейной 95-минутной градиентной хроматографией от 8% растворителя B до 50% растворителя B (A = 0,1% муравьиной кислоты в воде, B = 0,1% муравьиной кислоты в 80% ацетонитриле), затем линейно увеличивали до 98% B min. через 6 мин при скорости потока 300 нл/мин.Orbitrap Fusion Lumos собирает данные попеременно между полным сканированием MS и сканированием MS2 в зависимости от данных.Напряжение распыления устанавливали на уровне 2,1 кВ, а температуру ионно-транспортного капилляра составляли 320°С.Спектры МС (350–2000 м/з) собирали с разрешением 120 000, АРУ 4 × 105 и максимальным временем ввода 150 мс.10 наиболее распространенных многозарядных предшественников в каждом полном сканировании были фрагментированы с использованием HCD с нормализованной энергией столкновения 30%, окном квадрупольной изоляции 1,6 m/z и настройкой разрешения 30 000.Мишень AGC для тандемной масс-спектрометрии с использованием 5×104 и максимального времени ввода 150 мс.Динамическое исключение установлено на 30 секунд. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонениями для МС/МС. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС.未指定的离子或电荷为1+ или>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ или>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонениями для МС/МС. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС.
Необработанные данные обрабатываются с помощью вычислительной платформы FragPipe на базе MSFragger.Погрешности массы и соответствующие аминокислоты определяли с использованием алгоритма открытого поиска с допуском по массе предшественника от -150 до 500 Да.Затем идентифицировали модифицированные пептиды с использованием модификаций гистидина с приростом массы +229,0964 и +247,1069 Да в PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Клетки, стабильно экспрессирующие слитый ген miniSOG, высевали в чашки диаметром 6 см.При достижении ~80% слияния клетки однократно промывали HBSS (Gibco, #14025092), затем инкубировали с химическими зондами в HBSS в течение 1 часа при 37°C и освещали синим светом.Светодиод мощностью 10 Вт в течение 20 минут при комнатной температуре.Чтобы определить, какой тип активных форм кислорода участвует в PDPL, 0,5 мМ витамина С (MCE, #HY-B0166), 5 мМ тролокса (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), В качестве добавок к клеткам добавляли 100 мМ маннита (Energy Chemical, #69-65-8), 100 мкМ H2O2, 10 мМ NaN3.После промывания холодным PBS клетки соскребали, собирали в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и обрабатывали ультразвуком в течение 1 мин в 200 мкл PBS с 1x ингибитором протеазы без EDTA (1 с и 1 с без, амплитуда 35%).Полученную смесь центрифугировали при 15 871 × g в течение 10 мин при 4 °C, а концентрацию надосадочной жидкости доводили до 1 мг/мл с помощью набора для анализа белка BCA.Приблизительно 50 мкл вышеуказанного лизата инкубировали с 0,1 мМ азида родамина (Aladdin, № T131368), 1 мМ TCEP, 0,1 мМ лиганда TBTA и 1 мМ CuSO4 в течение 1 часа при комнатной температуре с вращением снизу вверх.После клик-реакции проводили осаждение ацетоном, добавляя к образцам 250 мкл предварительно охлажденного ацетона, инкубируя при -20°С в течение 20 мин и центрифугируя при 6010×g в течение 10 мин при 4°С.Соберите осадок и кипятите в 50 мкл 1x буфера Лэммли в течение 10 мин при 95 ° C.Затем образцы анализировали на длинных гелях SDS-PAGE и визуализировали с помощью системы визуализации Bio-rad ChemiDoc MP Touch с программным обеспечением Image Lab Touch.
Экспрессию и очистку рекомбинантного белка miniSOG-6xHis проводили, как описано ранее.Вкратце, клетки E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) трансформировали с помощью pET21a-miniSOG-6xHis, а экспрессию белка индуцировали с помощью 0,5 мМ IPTG (Sangon, #A600168).После лизиса клеток белки очищали с использованием агарозных гранул Ni-NTA (MCE, № 70666), диализовали против PBS и хранили при –80°C.
Для анализа близости метки in vitro на основе антител смешайте 100 мкМ очищенного miniSOG, 1 мМ зонда 3 и 1 мкг моноклонального антитела мыши против метки (TransGen, # HT501-01) в PBS до общего реакционного объема 50 мкл..Реакционную смесь облучали синим светодиодным светом в течение 0, 2, 5, 10 и 20 мин при комнатной температуре.Смесь инкубировали с 0,1 мМ биотин-ПЭГ3-азида (Aladdin, #B122225), 1 мМ TCEP, 0,1 мМ лиганда TBTA и 1 мМ CuSO4 в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере с восходящим движением.После быстрой реакции добавьте 4x буфера Лэммли непосредственно в смесь и кипятите при 95°C в течение 10 мин.Образцы анализировали на гелях SDS-PAGE и анализировали вестерн-блоттингом со стрептавидином-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Гистидинсодержащий синтетический пептид с С-концевым амидированием (LHDALDAK-CONH2) использовали для анализа мечения in vitro на основе близлежащих пептидов.В этом анализе 100 мкМ очищенного miniSOG, 10 мМ зонда 3 и 2 мкг/мл синтетического пептида смешивали в PBS в общем реакционном объеме 50 мкл.Реакционную смесь облучали синим светодиодным светом в течение 1 часа при комнатной температуре.Один микролитр образца анализировали с использованием системы ЖХ-МС (Waters, масс-спектрометр SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight с программным обеспечением для анализа спектра MassLynx).
Клетки HEK293T, стабильно экспрессирующие слитый ген miniSOG, высевали в чашки 10 см для линий с различной локализацией органелл (Mito, ER, Nucleus) и чашки 15 см для линий Parkin-miniSOG и BRD4-miniSOG.При достижении ~90% слияния клетки однократно промывали HBSS, затем инкубировали с зондом 3 в HBSS в течение 1 часа при 37°C и освещали синим светодиодом мощностью 10 Вт при комнатной температуре.Для бесконтактного мечения паркина добавляли 10 мкМ протонкарбонилцианидного носителя m-хлорфенилгидразона CCCP (Solarbio, #C6700) с зондом 3 в HBSS на 1 час при 37°C.Стадии лизиса клеток, клик-химии, восстановления и алкилирования были такими же, как описано выше, за исключением того, что добавляли 2 мг лизата и в клик-реакции использовали азид биотина PEG3 вместо фоторазлагаемого азида биотина.После обогащения гранулы промывали 3 раза по 5 мл PBS, содержащего 0,2% SDS, 3 раза по 5 мл PBS, содержащего 1 М мочевину, и 3 раза по 5 мл PBS.После этого 2 мкг трипсина добавляли к 300 мкл 25 мМ АВС, содержащего 1 М мочевину, для расщепления белка в течение ночи при 37°С.Реакцию останавливали добавлением муравьиной кислоты до достижения рН 2-3.После трипсинизации на шариках раствор пептида обессоливали с помощью колонки SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) и сушили в вакуумном концентраторе Speedvac.Пептиды повторно растворяли в 0,1% муравьиной кислоте и 500 нг пептидов анализировали с использованием масс-спектрометра Orbitrap Fusion Lumos Tribrid, оснащенного источником нано-ESI, описанным выше.Пептиды разделяли на коммерческих предварительных колонках ОФ-ВЭЖХ (75 мкм x 2 см) (Thermo, № 164946) и аналитических колонках ОФ-ВЭЖХ (75 мкм × 25 см) (Thermo, № 164941), заполненных 2 мкм.градиент от 8% до 35% ACN за 60 минут, затем линейно увеличивался до 98% B за 6 минут при скорости потока 300 нл/мин.Спектры МС (350-1500 m/z) собирали с разрешением 60000, AGC 4 × 105 и максимальным временем ввода 50 мс.Выбранные ионы были последовательно фрагментированы с помощью HCD в 3-секундных циклах с нормализованной энергией столкновения 30%, окном квадрупольной изоляции 1,6 m/z и разрешением 15000. Мишень AGC тандемного масс-спектрометра 5 × 104 и максимальное время инжекции 22 мс.Динамическое исключение установлено на 45 секунд. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонениями для МС/МС. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС.未指定的离子或电荷为1+ или>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ или>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонениями для МС/МС. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС.
Этапы подготовки образца вплоть до обогащения гранул NeutrAvidin были такими же, как и при анализе ЖХ-МС/МС, описанном выше.Приблизительно 50 мкг лизата использовали в качестве исходных данных для контроля нагрузки, а 2 мг лизата использовали для клик-реакций.После обогащения и промывки нейтравидином связанные белки элюировали добавлением 50 мкл буфера Лэммли к гранулам агарозной смолы и кипячением при 95°С в течение 5 минут.Введенную контрольную нагрузку и образцы, обогащенные гранулами, анализировали с помощью SDS-PAGE и переносили на мембраны PVDF (Millipore, #ISEQ00010) стандартными методами вестерн-блоттинга.Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком (Sangon, #A600669) в TBS, содержащем 0,1% твин-20 (TBST), и последовательно инкубировали с первичными и вторичными антителами.Первичные антитела разводили 1:1000 в 5% обезжиренном молоке в ТБСТ и инкубировали в течение ночи при 4°С.Вторичные антитела использовали в соотношении 1:5000 и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.Мембраны визуализировали с помощью хемилюминесценции с использованием системы визуализации Chemidoc MP.Все неразрезанные сканы блотов и гелей на рисунке представлены как необработанные данные.
Первичные антитела, использованные в этом исследовании, включали кроличье моноклональное антитело против SFPQ (CST, № 71992), кроличье моноклональное антитело против FUS (CST, № 67840), кроличье поликлональное антитело против NSUN2 (Proteintech, № 20854-1- AP), кроличье поликлональное антитело к mSin3A (Abcam, #ab3479), мышиное моноклональное антитело к метке (TransGen, #HT201-02), мышиное моноклональное антитело к β-актину (TransGen, #HC201-01), кроличье анти -CDK2 моноклональное антитело (ABclonal, #A0094), кроличье моноклональное антитело к CTBP1 (ABclonal, #A11600), кроличье поликлональное антитело к DUT (ABclonal, #A2901), кроличье поликлональное антитело к PSMC4 (ABclonal, #A2505), кроличье анти- Поликлональное антитело DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Эти антитела использовали в разведении 1:1000 в 5% обезжиренном молоке в ТБСТ.Вторичные антитела, использованные в этом исследовании, включали антикроличьи IgG (TransGen, #HS101-01), антимышиные IgG (TransGen, #HS201-01) в разведении 1:5000.
Для дальнейшего исследования того, взаимодействует ли BRD4 с SFPQ, стабильные клетки HEK293T и BRD4-miniSOG, сверхэкспрессирующие HEK293T, высевали в чашки диаметром 10 см.Клетки промывали холодным PBS и лизировали в 1 мл лизирующего буфера Pierce IP (Thermo Fisher, #87787) с ингибитором протеазы, не содержащим ЭДТА, в течение 30 минут при 4°C.После этого лизаты собирали в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугировали при 15 871 xg в течение 10 мин при 4°C.Супернатант собирали и инкубировали с 5 мкг меченного анти-V5 мышиного моноклонального антитела (CST, #80076) в течение ночи при 4°C.Промойте примерно 50 мкл магнитных шариков белка A/G (MCE, #HY-K0202) дважды с PBS, содержащим 0,5% Tween-20.Затем клеточные лизаты инкубировали с магнитными шариками в течение 4 часов при 4°С с вращением снизу вверх.Затем гранулы четыре раза промывали 1 мл буфера PBST и кипятили при 95°С в течение 5 мин.Образцы анализировали в гелях SDS-PAGE и переносили на мембраны PVDF с использованием стандартных методов вестерн-блоттинга.Мембраны блокировали в 5% обезжиренном молоке в ТБСТ и инкубировали последовательно с первичными и вторичными антителами.Первичное антитело Моноклональное антитело кролика против SFPQ (CST, #71992) использовали в соотношении 1:1000 в 5% обезжиренном молоке в TBST и инкубировали в течение ночи при 4°C.Антикроличий IgG использовали в соотношении 1:5000 и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.Мембраны визуализировали с помощью хемилюминесценции с использованием системы визуализации Chemidoc MP.
Все структуры, использованные для анализа площади поверхности, доступной для растворителя (SASA), были получены из банка данных белков (PDB)52 или базы данных белков AlphaFold53.Абсолютный SASA рассчитывали для каждого остатка с использованием программы FreeSASA.Только полные и однозначные данные SASA для меченого гистидина и его соседей использовались для получения среднего значения SASA для каждой структуры.Относительную доступность растворителя (RSA) для каждого гистидина рассчитывали путем деления абсолютного значения SASA на эмпирически максимально возможную площадь поверхности остатка, доступную для растворителя.Затем все гистидины классифицировались как скрытые, если среднее значение RSA было ниже 20%, в противном случае — открытые56.
Необработанные файлы, полученные в режиме DDA, искали с помощью Proteome Discoverer (v2.5) или MSfragger (Fragpipe v15.0) в соответствующей проверенной SwissProt базе данных белков, содержащей распространенные загрязнители.Для пептидов требовался полный трипсин с двумя отсутствующими сайтами расщепления, карбамоильное метилирование в качестве фиксированной модификации и окисление метионина в качестве динамической модификации.Допуски по весу прекурсора и фрагмента были установлены на 10 частей на миллион и 0,02 Да (MS2 Orbitrap) соответственно. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного обнаружения <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного обнаружения <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, чтобы получить белок отфильтрованного, чтобы получить коэффициент ложного заражения <1%. Попадания загрязняющих веществ удаляли, а белки фильтровали, чтобы получить уровень ложного обнаружения <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязнителей были удалены, а инфекции отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружений <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложноположительных результатов <1%.Для количественного анализа без использования меток использовали нормализованное содержание белка из трех биологических повторов.Анализ субклеточной локализации белка был выполнен с использованием анализа Gene Ontology (GO) от DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 и баз данных, скомпилированных и опубликованных группой Alice Ting.Карта вулкана была получена от Perseus (v1.6.15.0). Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую выявленность с использованием двустороннего t-критерия, и совпадение белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Кратность изменения содержания белка тестировали на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков определяли при изменении содержания >2 (если не указано иное) и значении р<0,05.使用 双边 t 检验 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 中 的 丰度 变化> 2 （除非 有 说明 说明 和 p 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明 和 p 值 <0,05。 Статистическая точность выявления кратности содержания ошибок проверяется с использованием двустороннего t-критерия, совпадения выявления количества ошибок для содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Статистическую значимость кратности изменений содержания белка проверяли с помощью двустороннего t-критерия, и совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и значений р<0,05.Анализ взаимодействия белков проводили с использованием анализа GO вместе с базой данных String.
Было проведено три биологических повтора с аналогичными результатами.Статистический анализ был выполнен с помощью GraphPad Prism (программное обеспечение GraphPad), а графики вулканов были созданы с помощью Perseus (v1.6.15.0).Для сравнения двух групп были определены значения p с использованием двустороннего критерия Стьюдента.Только одноэлементные белки, идентифицированные как минимум дважды в экспериментальной группе, были включены в графики вулканов, а соответствующие отсутствующие значения в контрольной группе были заменены на Perseus из нормального распределения, чтобы можно было рассчитать p-значение.Столбики погрешностей представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение.В протеомных анализах для статистического анализа сохранялось обилие белков, появлявшихся не менее чем в двух биологических повторностях.Статистические методы не использовались для предварительного определения размера выборки.Эксперименты не случайны.Исследователи не были слепы к задачам во время эксперимента и оценки результатов.
Для получения дополнительной информации о дизайне исследования см. реферат Отчета об исследованиях природы, связанный с этой статьей.
Данные масс-спектрометрии, полученные в этом исследовании, были отправлены в Консорциум ProteomeXchange через партнерский репозиторий iProX57 под идентификатором набора данных PXD034811 (набор данных PDPL-MS).Необработанные данные предоставляются в виде файлов необработанных данных.В статье приведены исходные данные.
Гинграс, А.С., Абэ, К.Т. и Раут, Б. Знакомство с окрестностями: использование биотинилирования, зависящего от близости, для характеристики белковых комплексов и картирования органелл. Гинграс, А.С., Абэ, К.Т. и Раут, Б. Знакомство с окрестностями: использование биотинилирования, зависящего от близости, для характеристики белковых комплексов и картирования органелл.Гинграс, А.С., Абэ, К.Т. и Раут, Б. Знакомство с окружающей средой: использование биотинилирования, зависящего от близости, для характеристики белковых комплексов и картирования органелл. Гинграс, AC, Эйб, К.Т. и Раут, Б. Гинграс, А.С., Эйб, К.Т. и Раут, Б. Понимание района: используйте зависимость района от биологической жизни.Гинграс, А.С., Абэ, К.Т. и Раут, Б. Понимание близости: характеристика белковых комплексов и картирование органелл с использованием биотинилирования, зависящего от близости.Текущий.Мое мнение.Химический.биология 48, 44–54 (2019).
Джери, Дж. Б. и соавт.Картирование микроокружения путем передачи энергии Декстера иммунным клеткам.Наука 367, 1091–1097 (2020).
Хертлинг, Э.Л. и соавт.Сети в масштабе двух протеомов обнаруживают клеточно-специфическое ремоделирование интерактома человека.Cells 184, 3022–3040.e3028 (2021).