Новости

Традиционные диагностические стратегии для выявления инфекционных заболеваний требуют использования настольных инструментов, которые не подходят для тестирования по месту оказания медицинской помощи (POCT).Развивающаяся микрофлюидика — это очень миниатюрная, автоматизированная и интегрированная технология, которая является потенциальной альтернативой традиционным методам быстрой, недорогой и точной диагностики на месте.Молекулярные методы диагностики широко используются в микрофлюидных устройствах как наиболее эффективные методы обнаружения возбудителей.В этом обзоре обобщаются последние достижения в молекулярной диагностике инфекционных заболеваний на основе микрофлюидов как с академической, так и с промышленной точек зрения.Во-первых, мы описываем типичную обработку нуклеиновых кислот на кристалле, включая предварительную обработку образца, амплификацию и считывание сигнала.Затем сравниваются характеристики, преимущества и недостатки четырех типов микрофлюидных платформ.Далее мы обсудим использование цифровых анализов для абсолютного количественного определения нуклеиновых кислот.Как классические, так и недавние коммерческие устройства молекулярной диагностики на основе микрофлюидов резюмируются как свидетельство текущего состояния рынка.Наконец, мы предлагаем будущие направления микрофлюидной диагностики инфекционных заболеваний.
Инфекционные заболевания вызываются патогенами, в том числе бактериями, вирусами и паразитами, распространенными по всему миру.В отличие от других болезней возбудители быстро инфицируются и распространяются между человеком и животными-хозяевами через инокуляцию, воздушные и водные среды [1].Профилактика инфекционных заболеваний имеет решающее значение как мера общественного здравоохранения.Три основные стратегии борьбы с инфекционными заболеваниями: (1) контролировать источник инфекции;(2) прерывание пути передачи;(3) защита восприимчивого населения.Среди основных стратегий контроль над источником инфекции считается наиболее важной стратегией из-за ее удобства и дешевизны.Быстрая диагностика, изоляция и лечение инфицированных людей имеют решающее значение и требуют быстрых, чувствительных и точных диагностических стратегий [2].Текущая диагностика инфекционных заболеваний обычно сочетает клиническое обследование, основанное на признаках и симптомах, и лабораторные исследования, такие как культура клеток и молекулярная диагностика, которые требуют обученного персонала, трудоемких процедур и дорогостоящего оборудования для тестирования [3, 4].Для предотвращения вспышек инфекционных заболеваний требуется быстрая, недорогая и точная локальная диагностика, особенно в районах с ограниченными ресурсами, где инфекционные заболевания распространены и тяжелы [5], а также лечение в условиях дикой местности или на поле боя, где чрезвычайные ситуации непредсказуемы..медицинская помощь ограничена [6].В этом контексте микрофлюидика представляет собой технологию, которая сочетает технологии микроэлектромеханических систем, нанотехнологии или материаловедение для точных манипуляций с жидкостями [7, 8, 9, 10], предоставляя новые возможности для обнаружения в месте оказания медицинской помощи (POCT).) инфекционные агенты вне больниц и лабораторий.По сравнению с традиционной диагностикой, требующей много времени, микрофлюидная технология обеспечивает экономию образцов и затрат на молекулярную диагностику во время вспышек заболеваний.Глобальное распространение коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) вызвано тяжелым острым респираторным синдромом коронавирус 2 (SARS-CoV-2), поэтому вновь подчеркивается важность микрофлюидики для своевременной профилактики и борьбы с пандемией [11, 12]. , 13].В отличие от традиционной диагностики, микрофлюидная POCT использует небольшие портативные устройства, начиная от настольных анализаторов и заканчивая небольшими тест-полосками для бокового потока для тестирования вблизи точки отбора проб [14].Эти тесты отличаются упрощенной подготовкой проб или ее отсутствием, быстрым усилением сигнала и чувствительными показаниями сигнала, что приводит к короткой продолжительности и точным результатам в течение нескольких минут.Доступность и массовое производство медицинских инструментов на основе микрофлюидов расширили возможности их рентабельного и прямого диагностического применения за пределами больницы, рядом с пациентом и даже дома.
Среди существующих стратегий диагностики инфекционных заболеваний молекулярная диагностика является одной из наиболее чувствительных [15, 16].Кроме того, молекулярная диагностика часто используется в качестве золотого стандарта для непрерывного обнаружения COVID-19, позволяя непосредственно обнаруживать вирус-специфические участки РНК или ДНК до начала иммунного ответа [17, 18].В текущем обзоре мы представляем последние достижения в процессах молекулярной диагностики инфекционных заболеваний на основе микрофлюидики, от академической точки зрения до будущих промышленных перспектив (рис. 1).Мы начнем с трех ключевых этапов обнаружения нуклеиновых кислот: предварительной обработки образцов на чипе, амплификации нуклеиновых кислот и считывания сигнала.Затем мы сравнили различные типы микрожидкостных платформ с их структурой и функциями, показав уникальные характеристики (сильные и слабые стороны).Цифровое обнаружение нуклеиновых кислот обсуждается далее и приводится в качестве примера технологии третьего поколения для абсолютного количественного определения молекул инфекционных патогенов.Кроме того, будут представлены несколько типичных и новейших коммерческих устройств POCT, чтобы продемонстрировать текущее состояние рынка микрофлюидных POCT для молекулярной диагностики.Мы также обсудим и объясним наше видение будущих приложений.
Модули микрожидкостных чипов для обнаружения нуклеиновых кислот можно разделить на три категории (выборка, распознавание и сигнализация) в соответствии с их функциями [19].Среди этих модулей модуль отбора проб в основном реализует лизис образца и извлечение нуклеиновой кислоты.Сенсорный модуль в основном управляет преобразованием и усилением сигналов нуклеиновых кислот.Сигнальный модуль обнаруживает сигнал, преобразованный и обработанный сенсорным модулем.Основываясь на процессе обнаружения нуклеиновых кислот на чипе, мы обобщим различные чипы, которые могут реализовать функцию «ввода и вывода».
Первым шагом в обнаружении нуклеиновых кислот является экстракция нуклеиновых кислот, т.е. выделение целевой нуклеиновой кислоты из исходного образца.Экстракция нуклеиновых кислот проводится для очистки нуклеиновых кислот от других молекулярных загрязнителей, обеспечения целостности первичной структуры молекул нуклеиновых кислот и оптимизации результатов.Экстракция нуклеиновой кислоты требует необходимого лизиса образца и захвата нуклеиновой кислоты, качество и эффективность которых имеют огромное влияние на результаты исследований и диагностики.Любые незначительные побочные эффекты во время экстракции могут ограничить дальнейшее обнаружение.Например, методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и петлевой изотермической амплификации (LAMP) ингибируются некоторыми остаточными органическими растворителями, такими как этанол и изопропанол, в реагентах для выделения нуклеиновых кислот [20].Жидкостно-жидкостная экстракция и твердофазная экстракция являются наиболее популярными методами выделения нуклеиновых кислот [21], однако жидкостно-жидкостная экстракция на чипе крайне ограничена, так как реагенты, используемые при жидкостно-жидкостной экстракции, вызывают коррозию большинства микрофлюидных чипов. .Здесь мы выделяем методы твердофазной экстракции на основе микрочипов и сравниваем их преимущества и недостатки.
Кремний является материалом подложки, совместимым с нуклеиновыми кислотами, благодаря его биосовместимости, стабильности и простоте модификации [22].Важно отметить, что при модификации диоксидом кремния или другими материалами этот композит проявляет свойства адсорбировать отрицательно заряженные нуклеиновые кислоты в условиях низкого pH и высокой концентрации соли при элюировании растворами с высоким pH и низким содержанием соли.На основе этого явления можно очистить нуклеиновую кислоту.
Различные формы материалов на основе диоксида кремния использовались для экстракции нуклеиновых кислот в микрофлюидике, такие как шарики диоксида кремния, порошки, фильтры из микроволокна и мембраны из диоксида кремния [23, 24, 25, 26].В зависимости от свойств материала материалы на основе кремния могут использоваться в микросхемах по-разному.Например, гранулы кремнезема, порошки и коммерческие нанофильтры можно просто поместить в поры или микроканалы микрожидкостных чипов и помочь извлечь нуклеиновые кислоты из образцов [27, 28, 29].Мембраны из диоксида кремния с модифицированной поверхностью также можно использовать для быстрой очистки ДНК от патогенов с низкими затратами.Например, Ван и др.[30] Комбинируя реакции денатурирующей амплификации с обменом цепи, опосредованным везикулами, с мембранами из диоксида кремния, покрытыми хитозановыми олигосахаридами, была представлена ​​универсальная портативная система, которая успешно обнаруживала 102–108 колониеобразующих единиц.(КОЕ)/мл Vibrio parahaemolyticus., и присутствие вируса было легко видно.Пауэлл и др.[31] Микрочипы на основе кремния затем использовались для обнаружения вируса гепатита С (ВГС), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса Зика и вируса папилломы человека, а также для автоматического размножения, в котором был разработан извилистый микрореактор объемом 1,3 мкл для захвата РНК-вирусов.и выполнить амплификацию на месте.В дополнение к этим методам микроколонки с поверхностно-модифицированным диоксидом кремния также играют ключевую роль в экстракции нуклеиновых кислот, поскольку геометрия и свойства модифицирующего материала значительно повышают эффективность экстракции.Чен и др.[32] предложили микрожидкостную платформу для выделения низкоконцентрированной РНК на основе кремниевых микроколонок с аминопокрытием.Это микрожидкостное устройство объединяет массив микростолбиков площадью 0,25 см2 на кремниевой подложке для достижения более высокой эффективности экстракции за счет конструкции с большим соотношением площади поверхности к объему.Преимущество этой конструкции заключается в том, что микрофлюидное устройство может достигать эффективности извлечения нуклеиновых кислот до 95%.Эти стратегии на основе кремния демонстрируют ценность быстрого выделения нуклеиновых кислот при низких затратах.В сочетании с микрофлюидными чипами стратегии извлечения на основе кремния могут не только повысить эффективность обнаружения нуклеиновых кислот, но и облегчить миниатюризацию и интеграцию аналитических устройств [20].
Методы магнитной сепарации используют магнитные частицы для выделения нуклеиновых кислот в присутствии внешнего магнитного поля.Обычно используемые магнитные частицы включают магнитные частицы Fe3O4 или γ-Fe2O3, покрытые кремнеземом, амино- и карбоксилом [33,34,35,36].Отличительной чертой магнитных частиц по сравнению с методами ТФЭ на основе кремния является простота манипулирования и контроля с помощью внешних магнитов.
Используя электростатическое взаимодействие между нуклеиновыми кислотами и кремнеземом, в условиях высокой соли и низкого рН нуклеиновые кислоты адсорбируются на поверхности магнитных частиц, покрытых кремнеземом, а в условиях низкой соли и высокого рН молекулы могут быть вымыты. опять таки..Магнитные шарики с кремнеземным покрытием позволяют извлекать ДНК из образцов большого объема (400 мкл) с помощью магнитоуправляемого движения [37].В качестве демонстрации Rodriguez-Mateos et al.[38] использовали перестраиваемые магниты для управления переносом магнитных шариков в разные камеры.На основе магнитных частиц, покрытых диоксидом кремния, 470 копий/мл геномной РНК SARS-CoV-2 могут быть извлечены из проб сточных вод для обнаружения обратной транскрипции LAMP (RT-LAMP), а ответ можно считать в течение 1 часа.невооруженным глазом (рис. 2а).
Устройства на основе магнитных и пористых материалов.Концептуальная схема микрожидкостного устройства IFAST RT-LAMP для обнаружения РНК SARS-CoV-2 (адаптировано из [38]).b Центробежное микроустройство для дТФЭ нуклеиновой кислоты буккального мазка (адаптировано из [39]).c Встроенный концентратор проб с автономным питанием, использующий карту FTA® (адаптировано из [50]).d Фильтровальная бумага Fusion 5, модифицированная хитозаном (адаптировано из [51]).SARS-CoV-2 тяжелый острый респираторный синдром коронавирус 2, изотермическая амплификация, опосредованная петлей обратной транскрипции RT-LAMP, технологические партнеры FTA finders, нуклеиновая кислота NA
Положительно заряженные магнитные частицы идеально подходят для присоединения фосфатного остова нуклеиновой кислоты.При определенной концентрации соли отрицательно заряженные фосфатные группы нуклеиновых кислот могут быть заряжены положительно на поверхности магнитных композитных частиц.Поэтому для экстракции нуклеиновых кислот были разработаны магнитные наночастицы с шероховатой поверхностью и высокой плотностью аминогрупп.После магнитной сепарации и блокирования магнитные наночастицы и комплексы ДНК могут быть непосредственно использованы в ПЦР, что устраняет необходимость в сложных и трудоемких операциях очистки и элюирования [35].Магнитные наночастицы, покрытые отрицательными карбоксильными группами, также использовались для разделения нуклеиновых кислот, адсорбированных на поверхности в высококонцентрированных растворах полиэтиленгликоля и хлорида натрия [36].С помощью этих магнитных гранул с модифицированной поверхностью экстракция ДНК совместима с последующей амплификации.Диньян и др.[39] описали автоматизированную и портативную центробежную микрофлюидную платформу для предварительной обработки нуклеиновых кислот, позволяющую нетехническому персоналу использовать ее на месте.Кроме того, совместимость выделенной ДНК с LAMP, методом, хорошо подходящим для анализа нуклеиновых кислот по месту оказания медицинской помощи, дополнительно демонстрирует минимальные требования к оборудованию и пригодность для колориметрических анализов (рис. 2b).
Методы магнитных шариков предлагают возможность автоматизированной экстракции, некоторые из которых существуют в коммерческих автоматических экстракторах нуклеиновых кислот [KingFisher;ThermoFisher (Уолтем, Массачусетс, США), QIAcube® HT;CapitalBio (Пекин, Китай) и Biomek®;Бекман (Майами, США).), Флорида, США)].Преимущества сочетания магнитных шариков с микрожидкостной техникой можно использовать для эффективного автоматизированного выделения нуклеиновых кислот, что потенциально может способствовать развитию молекулярной диагностики;тем не менее, сочетание магнитных шариков с микрофлюидикой по-прежнему в значительной степени зависит от сложных систем управления для точного манипулирования магнитными шариками, что объясняет популярность громоздких и дорогих коммерческих продуктов, что ограничивает дальнейшее применение магнитных шариков в POCT.
Несколько пористых материалов, таких как модифицированные нитроцеллюлозные фильтры, карты Finders Technology Associates (FTA), фильтровальная бумага на основе полиэфирсульфона и материалы с гликановым покрытием, также использовались для обнаружения нуклеиновых кислот [40, 41, 42, 43, 44].Пористые волокнистые материалы, такие как волокнистая бумага, были впервые использованы для выделения ДНК путем физического запутывания длинноцепочечных молекул ДНК волокнами.Мелкие поры приводят к сильному физическому ограничению молекул ДНК, что положительно влияет на извлечение ДНК.Из-за разного размера пор волокнистой бумаги эффективность экстракции не может удовлетворить потребности амплификации ДНК [45, 46].Карточка FTA представляет собой коммерческую фильтровальную бумагу, используемую в области судебной медицины и широко используемую в других областях молекулярной диагностики.Благодаря использованию целлюлозной фильтровальной бумаги, пропитанной различными химическими веществами для лизиса клеточных мембран в образце, высвобожденная ДНК защищена от деградации на срок до 2 лет.Совсем недавно была разработана пропитанная целлюлозная бумага для молекулярного обнаружения различных патогенов, включая SARS-CoV-2, лейшманиоз и малярию [47,48,49].ВИЧ в выделенной плазме лизируется напрямую, а вирусная нуклеиновая кислота обогащается в проточной мембране FTA®, встроенной в концентратор, что позволяет эффективно производить нуклеиновую кислоту [50] (рис. 2в).Основная проблема с обнаружением нуклеиновых кислот с использованием карт FTA заключается в том, что химические вещества, такие как гуанидин и изопропанол, ингибируют последующие реакции амплификации.Для решения этой проблемы мы разработали модифицированную хитозаном фильтровальную бумагу Fusion 5, которая сочетает в себе преимущества как физического переплетения молекул ДНК и волокнистой фильтровальной бумаги, так и электростатической адсорбции ДНК на хитозан-модифицированных соединениях для достижения высокоэффективного выделения нуклеиновых кислот. ..фильтрующие волокна [51] (рис. 2г).Точно так же Zhu et al.[52] продемонстрировали модифицированный хитозаном метод ПЦР, основанный на капиллярной микрожидкостной системе in situ для быстрого выделения и обнаружения РНК вируса Зика.Нуклеиновые кислоты могут быть адсорбированы/десорбированы в смешанной среде лизата/ПЦР, соответственно, на основании свойства включения/выключения хитозана.включения и выключения», в зависимости от pH.
Как упоминалось выше, эти стратегии сочетают в себе преимущества различных твердофазных материалов и повышают эффективность выделения нуклеиновых кислот в микрофлюидике.В практических применениях использование этих материалов в больших количествах неэкономично, и надлежащая обработка поверхности или модификация поверхности обычных материалов с помощью этих материалов также может сохранить их функцию.Поэтому считается, что реализация этих стратегий после пилотного исследования может снизить затраты.
При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидких платформах часто встречаются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация основных нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для выделения в сигнал, случайных для возникновения случаев (оптического, встречающегося и магнитного) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы проб (<100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот специальными зондами для преобразования их в удобный для последующего детектирования сигнал (оптический, электрический и магнитный). [53, 54].微流控 平台 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （(<100 мкл) ， 需要 使用 特定 探针 扩增 目标 核酸 ， 以 转换 为 下游 检测 （、 电学 和 磁学） 的 [53, 54 ]。微流控 平台 的 核酸 检测 使用 小样本量 （(<100 мкл) ， 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （、 电学 磁学） 的 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно имеет небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации основных нуклеиновых кислот с помощью специального зонда для обнаружения в обнаружении (оптического, наблюдаемого и магнитного) [53, 54]]. Для детекции нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно используются небольшие объемы проб (<100 мкл), что требует амплификации нуклеиновых кислот-мишеней специальными зондами для преобразования их в сигналы для последующей детекции (оптические, электрические и магнитные) [53, 54]] .Амплификация нуклеиновых кислот в микрофлюидике также может ускорить реакции, оптимизировать пределы обнаружения, снизить требования к образцам и повысить точность обнаружения [55, 56].В последние годы, с реализацией быстрого и точного обнаружения, в микрофлюидике стали применяться различные методы амплификации нуклеиновых кислот, включая ПЦР и некоторые реакции изотермической амплификации.В этом разделе будут обобщены методы обнаружения нуклеиновых кислот на основе микрожидкостных систем.
ПЦР — это моделирование процесса репликации ДНК организма, теория которого подробно описана в другом месте и здесь обсуждаться не будет.ПЦР может амплифицировать очень небольшое количество целевой ДНК/РНК с экспоненциальной скоростью, что делает ПЦР мощным инструментом для быстрого обнаружения нуклеиновых кислот.В последние десятилетия было разработано множество портативных микрофлюидных устройств, оснащенных системами термоциклирования ПЦР, для удовлетворения потребностей диагностики в месте оказания медицинской помощи [57, 58].ПЦР на кристалле можно разделить на четыре типа (обычный, непрерывный поток, пространственно переключаемый и конвективный ПЦР) в соответствии с различными методами контроля температуры [59].Например, Джи и др.[60] разработали метод количественной ПЦР с прямой обратной транскрипцией (RT-qPCR) на собственной микрожидкостной платформе для мультиплексного обнаружения вирусов SARS-CoV-2, гриппа A и B в образцах мазка из зева (рис. 3a).Парк и др.[61] построили простой чип для анализа патогенов, интегрировав тонкопленочную ПЦР, электроды и микрофлюидный модуль на основе полидиметилсилоксана, управляемый пальцем.Однако обе работы воплощают общие недостатки традиционной ПЦР.ПЦР требует термоциклирования, что ограничивает дальнейшую миниатюризацию устройства и сокращает время тестирования.
Разработка микрожидкостной ПЦР на основе непрерывного потока и ПЦР с переключением пространства имеет решающее значение для решения этой проблемы.Используя длинный змеевидный канал или короткий прямой канал, ПЦР с непрерывным потоком может обеспечить быструю амплификацию за счет активной циркуляции реагентов в трех зонах предварительного нагрева с помощью внешнего насоса.Эта операция успешно позволяет избежать фазы перехода между различными температурами реакции и, таким образом, значительно сократить время тестирования [62] (рис. 3б).В другом исследовании Jung et al.[63] предложили новый роторный генетический анализатор ПЦР, который сочетает в себе характеристики фиксированной и проточной ПЦР для ультрабыстрой и мультиплексной ПЦР с обратной транскрипцией (рис. 3в).Для амплификации нуклеиновых кислот ПЦР-микрочип будет вращаться через три нагревательных блока при разных температурах: 1. Блок денатурации 94°С, 2. Блок отжига при 58°С, 3. Блок расширения при 72°С.
Применение ПЦР в микрофлюидике.Схематическое изображение dirRT-qPCR на микрожидкостной платформе (адаптировано из [60]).b Схематическое изображение ПЦР-микрочипа с непрерывным потоком на основе змеевидного канала (адаптировано из [62]).в Схематическое изображение роторного генетического анализатора ПЦР, состоящего из микрочипа, трех нагревательных блоков и шагового двигателя (адаптировано из [63]).г Схема термоконвекционной ПЦР с центрифугированием и установкой (адаптировано из [64]).DirRT-qPCR, прямая количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
Используя капилляры и петли или даже тонкие планшеты, конвекционная ПЦР может быстро амплифицировать нуклеиновые кислоты за счет естественной свободной тепловой конвекции без необходимости во внешнем насосе.Например, циклическая олефиновая полимерная микрожидкостная платформа была разработана на изготовленном вращающемся нагревательном столике, использующем термоциклирование с центрифугированием в микроканале петли ПЦР [64] (рис. 3d).Реакционный раствор движется за счет тепловой конвекции, которая непрерывно обменивает высокую и низкую температуру в микроканале с кольцевой структурой.Весь процесс амплификации может быть завершен за 10 минут с пределом обнаружения 70,5 пг/канал.
Как и ожидалось, экспресс-ПЦР является мощным инструментом для полностью интегрированных систем молекулярной диагностики и мультиплексного анализа.Быстрая ПЦР значительно сокращает время, необходимое для выявления SARS-CoV-2, что способствует эффективному контролю пандемии COVID-19.
Для ПЦР требуется сложный термоциклер, который не подходит для POCT.Совсем недавно методы изотермической амплификации были применены к микрофлюидике, включая, помимо прочего, LAMP, рекомбиназную полимеразную амплификацию (RPA) и амплификацию на основе последовательностей нуклеиновых кислот [65,66,67,68].С помощью этих методов нуклеиновые кислоты амплифицируются при постоянной температуре, что облегчает создание недорогих высокочувствительных портативных устройств POCT для молекулярной диагностики.
Высокопроизводительные анализы LAMP на основе микрофлюидики позволяют многократно обнаруживать инфекционные заболевания [42, 69, 70, 71].В сочетании с центробежной микрожидкостной системой LAMP может дополнительно облегчить автоматизацию обнаружения нуклеиновых кислот [69, 72, 73, 74, 75].Спин-и-реагирующий SlipChip был разработан для визуального обнаружения множества параллельных бактерий с использованием LAMP [76] (рис. 4а).При использовании в анализе оптимизированной LAMP отношение сигнал/шум флуоресценции было примерно в 5 раз, а предел обнаружения достигал 7,2 копий/мкл геномной ДНК. Более того, с помощью этого метода было визуализировано наличие пяти распространенных бактериальных патогенов пищеварительного тракта, включая Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis и Vibrio parahaemolyticus, менее чем за 60 мин. Более того, с помощью этого метода было визуализировано наличие пяти распространенных бактериальных патогенов пищеварительного тракта, включая Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis и Vibrio parahaemolyticus, менее чем за 60 мин.Кроме того, с помощью этого метода менее чем за 60 минут было визуализировано присутствие пяти распространенных бактериальных патогенов пищеварительного тракта, включая Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis и Vibrio parahaemolyticus.此外 ， 基于 方法 在 <60 分钟 可 可 视化 了 五 常见 消化道 细菌病 原体 的 存在 ， 包括 蜡状 、 大 肠杆菌 、 沙门 氏 、 河流 弧菌 和 弧菌。。。。。。。。。。 弧菌此外 ， 基于 方法 在 <60 分钟 视化 视化 了 五 种 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 、 肠 氏 、 弧菌 和 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌Кроме того, с помощью этого метода менее чем за 60 минут было визуализировано присутствие пяти распространенных бактериальных желудочно-кишечных патогенов, включая Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius и Vibrio parahaemolyticus.
Преимущества LAMP в микрофлюидике включают, среди прочего, быстрое реагирование и миниатюрное обнаружение.Однако из-за температуры реакции (около 70 ° C) во время LAMP неизбежно образуются аэрозоли, что приводит к высокому уровню ложноположительных результатов.Специфичность анализа, дизайн праймера и контроль температуры также необходимо оптимизировать для LAMP.Кроме того, конструкции микросхем, которые реализуют обнаружение нескольких целей на одной микросхеме, имеют большое значение и должны быть разработаны.Кроме того, LAMP подходит для многоцелевого обнаружения, интегрированного в один чип, что имеет большое значение, но есть еще много возможностей для развития.
Высокая частота ложноположительных результатов LAMP может быть частично снижена с помощью RPA, поскольку относительно низкая температура реакции (~37 °C) приводит к относительно небольшому количеству проблем с испарением [77].В системе RPA два противоположных праймера инициируют синтез ДНК путем связывания с рекомбиназой, и амплификация может быть завершена в течение 10 минут [78,79,80,81].Поэтому весь процесс RPA намного быстрее, чем PCR или LAMP.В последние годы было показано, что микрофлюидная технология еще больше повышает скорость и точность RPA [82,83,84].Например, Лю и др.[85] разработали микрофлюидный анализ амплификации полимеразной рекомбиназы с интегрированным латеральным потоком для быстрого и чувствительного обнаружения SARS-CoV-2 путем интеграции RPA с обратной транскрипцией (RT-RPA) и универсальной системы обнаружения тест-полосок с латеральным потоком.в единую микрожидкостную систему.Рисунок 4б).Предел обнаружения составляет 1 копия/мкл или 30 копий/образец, и обнаружение может быть завершено примерно за 30 минут.Конг и др.разработали носимое микрожидкостное устройство.[86] использовали температуру тела и систему обнаружения флуоресценции на основе мобильного телефона для быстрого и прямого обнаружения ДНК ВИЧ-1 с использованием RPA (рис. 4c).Носимый анализ RPA обнаруживает 100 копий/мл целевой последовательности в течение 24 минут, демонстрируя большой потенциал для быстрой диагностики ВИЧ-1-инфицированных младенцев в условиях ограниченных ресурсов.
Изотермическая амплификация при тестировании по месту оказания медицинской помощи (POCT).Разработка и производство спиновых и реакционных SlipChip.После плазменной сварки верхняя и нижняя стружка были собраны с помощью набора гаек, чтобы сформировать окончательную стружку (адаптировано из [76]).b Схема системы MI-IF-RPA для обнаружения COVID-19 (адаптировано из [85]).c Схема носимого теста RPA для быстрого обнаружения ДНК ВИЧ-1 (адаптировано из [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM карбоксифлуоресцеин, вирус иммунодефицита человека ВИЧ, амплификация рекомбиназы RPA-полимеразы, светодиодный светодиод, MI-IF-RPA Microfluidics Integrated Lateral Flow Recombinase-Polimerase усиление
RPA на основе микрофлюидов быстро развивается, однако стоимость изготовления чипов и потребления реакции слишком высока и должна быть снижена, чтобы повысить доступность этой технологии.Кроме того, высокая чувствительность RPA может влиять на амплификацию неспецифических продуктов, особенно при наличии контаминации.Эти ограничения могут повлиять на применение RPA в микрожидкостных системах и заслуживают дальнейшей оптимизации.Хорошо разработанные праймеры и зонды для различных целей также необходимы для улучшения осуществимости микрофлюидных стратегий на основе RPA в POCT.
Cas13 и Cas12a обладают способностью произвольно расщеплять нуклеиновые кислоты и, таким образом, могут быть разработаны в качестве инструментов обнаружения и диагностики.Cas13 и Cas12a активируются при связывании с целевой ДНК или РНК соответственно.После активации белок начинает расщеплять другие близлежащие нуклеиновые кислоты, после чего направляющие РНК, нацеленные на патоген-специфические нуклеиновые кислоты, могут расщеплять погашенные флуоресцентные зонды и высвобождать флуоресценцию.Основываясь на этой теории, Kellner et al.[87] разработали основанный на Cas13 метод [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], а Broughton et al.[88] разработали другой подход, основанный на Cas12a [CRISPR Trans Reporter, нацеленный на ДНК-эндонуклеазу (DTECR)].
В последние годы появились различные методы детекции нуклеиновых кислот на основе CRISPR [89, 90].Обычные методы, основанные на CRISPR, часто требуют больших затрат времени и труда из-за множества процедур, включая выделение нуклеиновых кислот, амплификацию и обнаружение CRISPR.Воздействие жидкостей на воздух может увеличить вероятность ложноположительных результатов.Учитывая вышеизложенное, системы на основе CRISPR остро нуждаются в оптимизации.
Для приложений обнаружения CRISPR-Cas12a и CRISPR-Cas13a была разработана микрожидкостная платформа с пневматическим управлением, которая может выполнять 24 анализа параллельно [91].Система оснащена устройством обнаружения флуоресценции, которое обходит амплификацию нуклеиновых кислот и автоматически обнаруживает образцы фемтомолярной ДНК и РНК.Чен и др.[92] интегрировали амплификацию рекомбиназы с системой CRISPR-Cas12a в центробежной микрофлюидике (рис. 5а).Эта работа преодолевает трудности интеграции этих двух процессов, поскольку Cas12a может переваривать матричную ДНК и ингибировать процесс амплификации.Кроме того, Чен и соавт.[92] дополнительно предварительно хранили реагенты реакции в центробежном микрожидкостном контроле для автоматического завершения всего процесса.В другой работе Silva et al.[93] разработали метод диагностики без амплификации CRISPR/Cas12a и смартфона для обнаружения SARS-CoV-2 (рис. 5б).Этот анализ, известный как система без амплификации на основе сотового телефона, включает CRISPR/Cas-зависимый фермент, основанный на визуализации смартфоном сигналов пузырьков, генерируемых каталазой, в микрожидкостных каналах.Чувствительное обнаружение менее 50 копий/мкл нуклеиновой кислоты без предварительной амплификации, весь процесс от введения образца до считывания сигнала занимает всего 71 минуту.
Методы обнаружения нуклеиновых кислот на основе CRISPR.Центрифужная POCT для комплексной молекулярной диагностики на основе CRISPR (адаптировано из [92]).b Разработка теста CASCADE для анализа SARS-CoV-2 с помощью смартфона (адаптировано из [93]).Амплификация рекомбиназы RAA, соседний мотив протоспейсера PAM, кластеризованные короткие палиндромные повторы CRISPR через равные интервалы, система CASCADE без амплификации сотового телефона с CRISPR/CAS-зависимыми ферментами, 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид гидрохлорид EDC
В качестве последнего шага в обнаружении нуклеиновых кислот обнаружение сигнала напрямую отражает результаты диагностики и является решающим фактором в разработке эффективной, чувствительной и точной POCT.Сигналы можно считывать с использованием различных методов, таких как флуоресцентные, электрохимические, колориметрические и магнитные стратегии.В этом разделе мы опишем обоснование каждого подхода и сравним молекулярную диагностику инфекционных заболеваний в микрофлюидике.
Стратегии на основе флуоресценции широко используются для POCT-диагностики инфекционных заболеваний благодаря их замечательным преимуществам, заключающимся в превосходной чувствительности, низкой стоимости, простоте работы и анализе в месте оказания медицинской помощи [94, 95].В этих стратегиях используются меченые флуорофоры, такие как флуоресцентные красители и наноматериалы, для создания обнаруживаемого сигнала (усиление или гашение флуоресценции).Это открытие предполагает, что стратегии, основанные на флуоресценции, можно разделить на прямое флуоресцентное мечение, флуоресцентное обнаружение с включением и выключением сигнала [96].При прямом обнаружении флуоресцентной метки используются специальные флуоресцентные метки для маркировки определенных лигандов, которые генерируют определенное количество флуоресценции при селективном связывании с мишенью.Для обнаружения флуоресценции на основе сигнала качество флуоресцентного сигнала положительно связано с интересующей величиной.Интенсивность флуоресценции незначительна в отсутствие мишени и обнаруживается при наличии достаточного количества мишени.И наоборот, интенсивность флуоресценции, определяемая флуоресценцией «отключения сигнала», обратно пропорциональна количеству мишени, первоначально достигая максимального значения и постепенно уменьшаясь по мере увеличения мишени.Например, используя механизм зависимого от мишени транс-расщепления CRISPR-Cas13a, Tian et al.[97] разработали новую стратегию распознавания для обнаружения РНК, которые напрямую обходят обратную транскрипцию (Fig. 6a).При связывании с комплементарными РНК-мишенями комплекс CRISPR-Cas13-РНК может активироваться, вызывая трансколлатеральное расщепление неспецифическими репортерными РНК.Флуоресцентно меченный репортер [флуорофор (F)] гасится гасителем (Q) в неизменном виде и флуоресцирует при расщеплении активированным комплексом.
Преимуществом электрохимического обнаружения является высокая скорость обнаружения, простота производства, низкая стоимость, удобство переноски и автоматическое управление.Это мощный аналитический метод для приложений POCT.На основе графеновых полевых транзисторов Gao et al.[98] разработали нанобиосенсор для мультиплексной детекции антигенов болезни Лайма из бактерий Borrelia burgdorferi с пределом обнаружения 2 пг/мл (рис. 6б).
Колориметрические анализы использовались в приложениях POCT, извлекая выгоду из преимуществ портативности, низкой стоимости, простоты подготовки и визуального считывания.Колориметрическое обнаружение может использовать окисление пероксидазы или пероксидазоподобных наноматериалов, агрегацию наноматериалов и добавление индикаторных красителей для преобразования информации о присутствии целевых нуклеиновых кислот в видимые изменения цвета [99, 100, 101].Примечательно, что наночастицы золота широко используются при разработке колориметрических стратегий, и благодаря их способности вызывать быстрые и значительные изменения цвета растет интерес к разработке колориметрических платформ POCT для диагностики инфекционных заболеваний in situ [102].С помощью встроенного центрифужного микрожидкостного устройства [103] пищевые патогены в образцах зараженного молока могут быть автоматически обнаружены на уровне 10 бактериальных клеток, а результаты можно считывать визуально в течение 65 минут (рис. 6с).
Методы магнитного зондирования могут точно обнаруживать аналиты с использованием магнитных материалов, и в последние десятилетия наблюдается значительный интерес к приложениям POCT.Методы магнитного зондирования имеют некоторые уникальные преимущества, такие как недорогие магнитные материалы, а не дорогие оптические компоненты.Однако использование магнитного поля повышает эффективность детектирования и сокращает время пробоподготовки [104].Кроме того, результаты магнитного зондирования демонстрируют высокую специфичность, чувствительность и высокое отношение сигнал/шум из-за незначительного сигнала магнитного фона биологических образцов [105].Шарма и др.интегрировали биосенсор на основе магнитного туннельного перехода в портативную платформу микрочипа.[106] для мультиплексной детекции возбудителей (рис. 6г).Биосенсоры чувствительно обнаруживают субнаномолярные нуклеиновые кислоты, выделенные из патогенов.
Типичный метод обнаружения сигнала.Концепция гиперлокализованного обнаружения Cas13a (адаптировано из [97]).b Графеновый нанобиосенсор FET в сочетании с Lyme GroES scFv (адаптировано из [98]).в Колориметрические показания для мультиплексного обнаружения пищевых патогенов в центробежном микрожидкостном чипе: образцы № 1 и № 3 с целевыми патогенами и образцы № 2, № 4 и № 5 без целевых патогенов (адаптировано из [103]) .г Биосенсор на основе магнитного туннельного перехода, включающий платформу, встроенный блокирующий усилитель, блок управления и блок питания для генерации/сбора сигналов (адаптировано из [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA полиметилметакрилат
Несмотря на отличные характеристики вышеперечисленных методов обнаружения, они все же имеют недостатки.Эти методы сравниваются (таблица 1), включая некоторые приложения с деталями (за и против).
С развитием микрофлюидики, микроэлектромеханических систем, нанотехнологий и материаловедения использование микрофлюидных чипов для обнаружения инфекционных заболеваний постоянно расширяется [55,96,107,108].Точное манипулирование миниатюрным оборудованием и жидкостями способствует точности диагностики и экономичности.Поэтому для дальнейшего развития были предприняты усилия по оптимизации и модернизации чипов, в результате чего появились различные микрожидкостные чипы с различной структурой и функциями.Здесь мы кратко представляем несколько распространенных типов микрожидкостных платформ и сравниваем их характеристики (за и против).Кроме того, большинство приведенных ниже примеров сосредоточены в первую очередь на борьбе с SARS-CoV-2.
LOCC являются наиболее распространенными миниатюрными комплексными аналитическими системами, и их операции очень миниатюризированы, интегрированы, автоматизированы и распараллелены от ввода и подготовки пробы, управления потоком и обнаружения жидкости [109, 110].Управление жидкостями осуществляется с помощью тщательно продуманной геометрии и взаимодействия многих физических эффектов, таких как градиенты давления, капиллярное действие, электродинамика, магнитные поля и акустические волны [111].LOCC демонстрирует отличные преимущества в высокопроизводительном скрининге и множественном обнаружении, с высокой скоростью анализа, небольшим размером выборки, низким энергопотреблением и высокой эффективностью управления и эксплуатации;однако устройства LOCC очень деликатны в плане производства, упаковки и сопряжения.Однако мультиплексирование и повторное использование сталкиваются с огромными трудностями [96].По сравнению с другими платформами LOCC обладает уникальными преимуществами с точки зрения максимального разнообразия приложений и наилучшей совместимости технологий, но очевидны и ее недостатки, а именно высокая сложность и плохая повторяемость.Зависимость от внешних насосов, которые часто бывают громоздкими и дорогими, еще больше ограничивает их использование в POCT.
Во время вспышки COVID-19 LOCC привлекло большое внимание.В то же время появилось несколько новых чипов, сочетающих в себе несколько технологий.Например, смартфоны в настоящее время широко используются в качестве портативных аналитических устройств и имеют большой потенциал для интеграции LOCC.Сан и др.[21] изготовили микрожидкостный чип, позволяющий мультиплексировать специфические последовательности нуклеиновых кислот пяти патогенов, в том числе SARS-CoV-2, с помощью LAMP и проанализировали их с помощью смартфона в течение 1 часа после окончания реакции.В качестве другого примера Sundah et al.[112] создали молекулярный переключатель [каталитическая амплификация с помощью молекулярного переключателя переходного состояния (CATCH)] для прямого и чувствительного обнаружения РНК-мишеней SARS-CoV-2 с помощью смартфонов. CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копий РНК/мкл; < 1 ч при комнатной температуре) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копий РНК/мкл; < 1 ч при комнатной температуре) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC и использует превосходную производительность (примерно 8 копий РНК/мкл; < 1 ч при температуре окружающей среды) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копий РНК/мкл; < 1 ч при комнатной температуре) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 РНК 拷贝/мкл；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 РНК 拷贝/мкл；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH совместим с переносимыми LOCC и обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/мкл; < 1 часа при температуре окружающей среды) [112]. CATCH совместим с портативными LOCC и обладает превосходными характеристиками (примерно 8 копий РНК/мкл; < 1 часа при комнатной температуре) [112].Кроме того, устройства LOCC для молекулярной диагностики также используют некоторые движущие силы, такие как вакуум, растяжение и электрические поля.Канг и др.[113] продемонстрировали сверхбыструю ПЦР с наноплазмой на чипе в режиме реального времени для быстрой и количественной диагностики COVID-19 в полевых условиях с использованием вакуумного плазмонного жидкостного ПЦР-чипа.Ли и др.[114] впоследствии разработали управляемый растяжением микрожидкостный чип, который позволил диагностировать COVID-19.Платформа использует систему усиления RT-LAMP, чтобы определить, является ли образец качественно положительным или отрицательным.Впоследствии Ramachandran et al.[115] добились соответствующих градиентов электрического поля с помощью изотахофореза (ITP), метода селективной фокусировки ионов, реализованного в микрофлюидике.С помощью ITP целевая РНК из необработанных образцов мазков из носоглотки может быть автоматически очищена.Затем Рамачандран и др.[115] Сочетание этой очистки ITP с анализами LAMP и CRISPR с усилением ITP позволило обнаружить SARS-CoV-2 в мазке из носоглотки человека и клинических образцах примерно за 35 минут.Кроме того, постоянно появляются новые идеи.Джадхав и др.[116] предложили диагностическую схему, основанную на рамановской спектроскопии с усилением поверхности в сочетании с микрожидкостным устройством, содержащим либо вертикально ориентированные углеродные нанотрубки с покрытием из золота/серебра, либо одноразовые микро-/нанотрубки, полученные методом электропрядения.Мембранные встроенные фильтрующие микроканалы являются одноразовыми.Устройство адсорбирует вирусы из различных жидкостей/выделений организма, таких как слюна, носоглотка и слезы.Таким образом, титр вируса является обильным, и вирус может быть точно идентифицирован по сигнатуре комбинационного рассеяния.
LOAD представляет собой центробежную микрофлюидную платформу, в которой все процессы контролируются частотным протоколом, вращающим микроструктурированный субстрат [110].Устройство LOAD характеризуется использованием центробежной силы в качестве важной движущей силы.На жидкости также действуют капиллярные силы, силы Эйлера и Кориолиса.Используя центрифугу, анализы выполняются в непрерывном режиме жидкости от радиального внутреннего до внешнего положения, что устраняет необходимость в дополнительных внешних трубках, насосах, исполнительных механизмах и активных клапанах.Короче говоря, единый метод управления упрощает работу.Силы, действующие на жидкость в одном и том же микрожидкостном канале на одном и том же расстоянии от центра нагрузки, равны, что позволяет повторить структуру канала.Таким образом, оборудование LOAD проще и экономичнее в разработке и производстве, чем обычное оборудование LOCC, в то время как реакции в значительной степени независимы и параллельны;однако из-за высокой механической прочности центробежного оборудования доступный материал для стружки ограничен, а небольшие объемы затруднительны.к машине.В то же время большинство устройств LOAD предназначены только для одноразового использования, что дорого для крупномасштабного обнаружения [96, 117, 118, 119].
В последние десятилетия LOAD, считающийся одним из самых многообещающих микрофлюидных устройств, привлек значительное внимание исследователей и производителей.Таким образом, LOAD получил широкое признание и использовался для молекулярной диагностики инфекционных патогенов [120, 121, 122, 123, 124], особенно во время вспышки COVID-19.Например, в конце 2020 года Ji et al.[60] продемонстрировали прямой анализ RT-qPCR для быстрого и автоматизированного параллельного обнаружения инфекции SARS-CoV-2 и гриппа A и B в образцах мазка из зева.Затем Сюн и др.[74] представили интегрированную в LAMP дискоидную микрожидкостную платформу для быстрого, точного и одновременного обнаружения семи респираторных коронавирусов человека, включая SARS-CoV-2, в течение 40 минут.В начале 2021 года де Оливейра и соавт.[73] продемонстрировали центробежный микрожидкостный чип из полистиролового тонера, управляемый вручную с помощью вращателя на кончике пальца, для молекулярной диагностики COVID-19 с помощью RT-LAMP.Впоследствии Дигнан и соавт.[39] представили автоматизированное портативное центрифужное микроустройство для очистки РНК SARS-CoV-2 непосредственно из срезов буккальных мазков.Медведь и др.[53] предложили встроенную систему отбора проб аэрозоля SARS-CoV-2 с вращающимся микрожидкостным флуоресцентным чипом небольшого объема с пределом обнаружения 10 копий/мкл и минимальным порогом цикла 15 минут.Суарес и др.[75] недавно сообщили о разработке интегрированной модульной центробежной микрожидкостной платформы для прямого обнаружения РНК SARS-CoV-2 в образцах мазков из носоглотки, инактивированных нагреванием, с использованием LAMP.Эти примеры демонстрируют большие преимущества и перспективы LOAD в молекулярной диагностике COVID-19.
В 1945 г. Muller и Clegg [125] впервые представили микрожидкостные каналы на бумаге с использованием фильтровальной бумаги и парафина.В 2007 году группа Whitesides [126] создала первую функциональную бумажную платформу для тестирования белков и глюкозы.Бумага стала идеальной подложкой для микрофлюидики.Бумаге присущи такие свойства, как гидрофильность и пористая структура, превосходная биосовместимость, малый вес, гибкость, возможность складывания, низкая стоимость, простота использования и удобство.Классические µPAD состоят из гидрофильных/гидрофобных структур, построенных на бумажных подложках.В зависимости от трехмерной структуры μPAD можно разделить на двухмерные (2D) и трехмерные (3D) μPAD.2D µPAD производятся путем формирования гидрофобных границ для формирования микрожидкостных каналов, в то время как 3D µPAD обычно изготавливаются из стопок слоев 2D микрожидкостной бумаги, иногда путем складывания бумаги, методов скольжения, открытых каналов и 3D-печати [96].Водные или биологические жидкости на μPAD в основном контролируются капиллярной силой без внешнего источника питания, что облегчает предварительное хранение реагентов, работу с образцами и мультиплексное обнаружение.Однако точному управлению потоком и мультиплексному обнаружению мешают недостаточная скорость обнаружения, чувствительность и возможность повторного использования [96, 127, 128, 129, 130].
Как необычная микрожидкостная платформа, μPAD широко рекламировалась и разрабатывалась для молекулярной диагностики инфекционных заболеваний, таких как ВГС, ВИЧ и SARS-CoV-2 [131, 132].Для селективного и чувствительного обнаружения ВГС Tengam et al.[133] разработали новый биосенсор на основе флуоресцентной бумаги с использованием высокоспецифичного зонда нуклеиновой кислоты на основе пирролидинилпептида.Нуклеиновые кислоты ковалентно иммобилизуют на частично окисленной целлюлозной бумаге путем восстановительного алкилирования между аминогруппами и альдегидными группами, а обнаружение основано на флуоресценции.Эти сигналы может считывать специально изготовленный гаджет с портативной флуоресцентной камерой в сочетании с камерой мобильного телефона.Впоследствии Лу и соавт.[134] разработали гибкий электрод на бумажной основе на основе композитов металлоорганического каркаса из наночастиц никеля/золота/углеродных нанотрубок/поливинилового спирта для обнаружения мишеней ВИЧ путем гибридизации ДНК с использованием метиленового синего в качестве окислительно-восстановительного индикатора ДНК.Совсем недавно Chowdury et al.[135] представили гипотетический дизайн платформы для тестирования µPAD по месту оказания медицинской помощи с использованием необработанной слюны пациента в сочетании с LAMP и портативной технологией визуализации для обнаружения аналита COVID-19.
Испытания на боковое течение направляют жидкости за счет капиллярных сил и контролируют движение жидкости за счет смачиваемости и характеристик пористых или микроструктурированных субстратов.Устройства бокового потока состоят из пробы, конъюгата, инкубатора и детектора, а также впитывающих прокладок.Молекулы нуклеиновых кислот в LFA распознают специфические связывающие вещества, которые предварительно хранятся в месте связывания и связываются в виде комплексов.Когда жидкость проходит через планшеты для инкубации и обнаружения, комплексы захватываются молекулами захвата, расположенными на тестовой и контрольной линиях, показывая результаты, которые можно считывать непосредственно невооруженным глазом.Как правило, LFA можно выполнить за 2–15 минут, что быстрее, чем традиционное обнаружение.Благодаря специальному механизму LFA требует мало операций и не требует дополнительного оборудования, что делает его очень удобным в использовании.Его легко изготовить и миниатюризировать, а стоимость подложек на бумажной основе ниже.Однако он используется только для качественного анализа, и количественное обнаружение очень сложно, а способность к мультиплексированию и пропускная способность очень ограничены, и одновременно может быть обнаружена только одна достаточная нуклеиновая кислота [96,110,127].
Хотя большинство применений LFA сосредоточено на иммуноанализах, использование LFA для молекулярной диагностики в микрожидкостных чипах также эффективно и популярно [136].В случае вируса гепатита В, ВИЧ и SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] предложили платформу LFA наночастиц с повышающей конверсией и продемонстрировали универсальность этой миниатюрной и портативной платформы благодаря чувствительному и количественному обнаружению множества мишеней, таких как нуклеиновая кислота HBV.Кроме того, Фу и соавт.[138] продемонстрировали новый LFA, основанный на рамановской спектроскопии с усилением поверхности, для количественного анализа ДНК ВИЧ-1 в низких концентрациях.Для быстрого и чувствительного обнаружения SARS-CoV-2 Liu et al.[85] разработали микрофлюидно-интегрированный анализ бокового потока RPA, объединив RT-RPA и универсальную систему обнаружения бокового потока в единую микрофлюидную систему.
Применение различных микрожидкостных платформ варьируется в зависимости от конкретных исследований, в полной мере используя возможности и преимущества платформ.Благодаря доступным по цене клапанам, насосам и воздуховодам LOCC представляет собой наиболее комплексную платформу для разнообразия приложений и функциональной совместимости с огромным пространством для развития.Поэтому мы надеемся и рекомендуем провести новейшие исследования в LOCC в качестве первой попытки и оптимизировать условия.Кроме того, ожидается, что в системе будут обнаружены и использованы более эффективные и точные методы.LOAD отличается точным управлением жидкостями от существующих устройств LOCC и демонстрирует уникальные преимущества в одиночных приводах за счет центробежной силы без необходимости использования внешних приводов, в то время как параллельные реакции могут быть отдельными и синхронизированными.Таким образом, в будущем LOAD станет основной микрофлюидной платформой с меньшим количеством ручных операций и более зрелыми и автоматизированными технологиями.Платформа µPAD сочетает в себе преимущества LOCC и материалов на бумажной основе для недорогой одноразовой диагностики.Поэтому дальнейшее развитие должно быть сосредоточено на удобных и хорошо зарекомендовавших себя технологиях.Кроме того, LFA хорошо подходит для обнаружения невооруженным глазом, обещая сократить расход образца и ускорить обнаружение.Подробное сравнение платформ показано в таблице 2.
Цифровой анализ делит образец на множество микрореакторов, каждый из которых содержит дискретное количество молекул-мишеней [139, 140].Цифровые анализы предлагают значительные преимущества для выполнения абсолютного количественного анализа, выполняя тысячи параллельных биохимических экспериментов одновременно и индивидуально в отсеках микронного масштаба, а не в непрерывной фазе.По сравнению с традиционной микрофлюидикой компартментные реакции могут уменьшить объем образца, повысить эффективность реакции и легко интегрироваться с другими аналитическими методами без необходимости в каналах, насосах, клапанах и компактных конструкциях [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].Следующие два метода используются в цифровых анализах для достижения однородного и точного разделения растворов, включая реагенты и образцы, такие как клетки, нуклеиновые кислоты и другие частицы или молекулы: (1) капельные эмульсии, использующие нестабильность поверхности жидкости;(2) деление массива осуществляется по геометрическим ограничениям устройства.В первом методе капли, содержащие реагенты и образцы в микроканалах, могут быть созданы пассивными методами, такими как прямоток, перекрестный поток, фокусировка потока, поэтапное эмульгирование, микроканальное эмульгирование и мембраны за счет сил вязкого сдвига и эмульгирование со сменой канала.локализации [143, 145, 146, 148, 149] или с помощью активных методов [150, 151], которые вводят дополнительную энергию за счет электрического, магнитного, теплового и механического контроля.В последнем подходе наилучшая однородность объема жидкости в микрофлюидных камерах достигается за счет сохранения пространственных структур одинакового размера, таких как микроямки и поверхностные массивы [152,153,154].Примечательно, что капли являются основными секциями потока, которые также можно генерировать и управлять ими на массивах электродов на основе цифровой микрофлюидики (DMF).Электросмачивание диэлектриков является одной из наиболее изученных теорий ДМФ, поскольку электросмачивание диэлектриков позволяет точно манипулировать отдельными каплями, контролировать форму жидкости и асимметричные электрические сигналы, проходящие через разные стороны [141, 144].К основным операциям с каплями в ДМФА относятся сортировка, расщепление и слияние [151, 155, 156], что может найти применение в различных областях анализа, особенно в молекулярной детекции [157, 158, 159].
Цифровое обнаружение нуклеиновых кислот — это технология молекулярной диагностики третьего поколения, следующая за традиционной ПЦР и количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР), параллельно с высокопроизводительным секвенированием и жидкостной биопсией.В последние два десятилетия цифровые нуклеиновые кислоты получили быстрое развитие в области молекулярной диагностики инфекционных патогенов [160, 161, 162].Абсолютная количественная оценка цифрового обнаружения нуклеиновых кислот начинается с упаковки образцов и реагентов в отдельные отсеки, чтобы гарантировать, что каждая целевая последовательность имеет одинаковую вероятность попадания в каждый отдельный отсек.Теоретически каждой секции может быть назначено несколько последовательностей-мишеней, или может не быть независимой системы микрореакций.С помощью различных сенсорных механизмов, описанных выше, компартменты с микробными целевыми последовательностями, которые генерируют сигналы выше определенного порога, могут быть визуализированы невооруженным глазом или с помощью машины и помечены как положительные, в то время как другие компартменты, которые генерируют сигналы ниже порога, помечены как положительные. .отрицательные, которые делают сигнал для каждого раздела логическим.Таким образом, путем расчета количества созданных компартментов и доли положительных результатов после реакции исходные копии тестируемых образцов могут быть сопоставлены с использованием формулы распределения Пуассона без необходимости использования стандартной кривой, которая требуется для рутинных количественных анализов, таких как как кПЦР.[163] По сравнению с традиционными методами молекулярной диагностики цифровое обнаружение нуклеиновых кислот имеет более высокую степень автоматизации, более высокую скорость и чувствительность анализа, меньшее количество реагентов, меньшее загрязнение и более простую конструкцию и производство.По этим причинам использование цифровых анализов, особенно методов на основе капель, для молекулярной диагностики, сочетающих методы амплификации и считывания сигнала, было хорошо изучено во время критической вспышки SARS-CoV-2.Например, Инь и др.[164] объединили капельный цифровой и быстрый методы ПЦР для обнаружения генов ORF1ab, N и РНКазы P в SARS-CoV-2 в микрофлюидном чипе.Примечательно, что система смогла идентифицировать положительный сигнал в течение 115 секунд, что быстрее, чем обычная ПЦР, что указывает на ее эффективность при обнаружении по месту оказания медицинской помощи (рис. 7а).Донг и др.[165], Соу и соавт.[157], Чен и соавт.[166] и Альтери и соавт.[167] также применили капельную цифровую ПЦР (ddPCR) для обнаружения SARS-CoV-2 в микрожидкостной системе с впечатляющими результатами.Для дальнейшего повышения скорости обнаружения Shen et al.[168] добились визуализации чипа на основе ddPCR всего за 15 с без использования методов сшивания изображений, что ускорило технологический процесс ddPCR от лаборатории до приложения.Применяются не только методы термической амплификации, такие как ПЦР, но и методы изотермической амплификации для упрощения условий реакции и быстрого отклика.Лу и др.[71] разработали SlipChip для анализа капель, способный генерировать капли различных размеров с высокой плотностью за один этап и количественно определять нуклеиновые кислоты SARS-CoV-2 с помощью цифрового LAMP (рис. 7b).Будучи быстро развивающейся технологией, CRISPR также может играть важную роль в цифровом обнаружении нуклеиновых кислот с помощью удобной колориметрической визуализации без необходимости дополнительных окрашиваний нуклеиновых кислот.Аккерман и др.разработал комбинаторную матричную реакцию для мультиплексной оценки нуклеиновых кислот.[158] обнаружили 169 вирусов, связанных с человеком, включая SARS-CoV-2, в каплях, содержащих реагенты для обнаружения нуклеиновых кислот на основе CRISPR-Cas13, в микролуночном анализе (рис. 7c).Кроме того, в одной системе можно использовать изотермическую амплификацию и технологию CRISPR, чтобы объединить преимущества обоих.Парк и др.[169] Цифровой анализ CRISPR/Cas12a был разработан в коммерческом микрофлюидном чипе для обнаружения извлеченного и убитого нагреванием SARS-CoV-2 на основе одноэтапной RT-RPA с более коротким и более высоким отношением сигнала к фону. соотношение времени., более широкий динамический диапазон и лучшую чувствительность (рис. 7d).Некоторые описания этих примеров приведены в таблице 3.
Типичная цифровая платформа для обнаружения нуклеиновых кислот.a Рабочий процесс быстрой цифровой ПЦР состоит из четырех ключевых этапов: подготовка образца, распределение реакционной смеси, процесс амплификации и количественная оценка мишени (адаптировано из [164]).b Схема, показывающая анализ капель SlipChip для образования капель при высокой плотности (адаптировано из [71]).c Диаграмма рабочего процесса CARMEN-Cas13 (адаптировано из [158]).d Обзор передового цифрового обнаружения вирусов с помощью CRISPR/Cas в одном горшке (адаптировано из [169]).W/O вода-в-масле, полидиметилсилоксан PDMS, ПЦР-полимеразная цепная реакция, сбор данных DAQ, пропорциональная интегральная производная PID, комбинаторная матричная реакция CARMEN для мультиплексной оценки нуклеиновых кислот, SARS-CoV-2, тяжелый острый респираторный синдром, коронавирус 2, Амплификация обратной транскриптазы рекомбиназы полимеразы-RPA, сигнал S/B на заднем плане